eRF3b羧基部分多肽片段的分子克隆、表达及抗体制备.pdfVIP

中文摘 英文摘 研究论 日U 材 · 结 附 讨 结 参 综述 致谢… 个人简 中文摘要 eRF3b羧基端部分多肽片段的分子克隆、表达及抗体制备 摘 要 目的：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(皿V)引起的一种在世 界范围内广为流行的一种疾病，是已知各型肝炎中危害最严重的一种。 我国是世界肝炎大国，大约有7亿人感染过乙肝，即总感染率为57％； 有2300万慢性肝炎患者，9300万乙肝病毒携带者；每年因肝炎死亡的 人数约有23万人【l】。鉴于上述原因，我国在乙肝的预防和治疗上也花费 了很多费用，有报导可见每年防治乙肝的经费约500亿人民币【2，31。尽管 对于乙肝的研究很多，但是乙肝迄今为止也没有很好的治愈方法，所以 乙肝对全国人民的健康水平和国家财政收入都造成了很大的威胁。因 此，临床上迫切需要研究新的灵敏度和特异度都较高的诊断方法，并且 发现新的有价值的生物标志物，争取做到早预防、早诊断、早治疗，改 善病人情况。 研究乙型病毒性肝炎机制及其制备eRF3b羧基端部分多肽片段多 克隆抗体，具有重大意义。本室前期利用MALDI．TOFMS技术发现 蛋白合成中止的功能。eRF3b在肝脏感染乙肝病毒后的免疫反应过程中 发挥了极其重要的作用，4210Da多肽作为其中一部分肽段而不断出现 在血液中，而且表达量在不同肝病组中差异明显，提示该蛋白可以作为 中筛检肝癌(HCC)患者的生物学标志物【11。 究，其间含有111个碱基，因此称其基因为GSPT2．111，其对应的蛋白 抗体和GST．eRF3b．37大鼠多克隆抗体，为今后研究乙肝标志物提供了 依据，同时为乙肝分子流行病学研究奠定了基础。 方法： 中文摘要 I和EcoR 基因片段。将GSPT2．111基因片段通过BamHI两个酶切位点 粒，用BamHI和EcoRI双酶切后进行质粒PCR鉴定及测序分析。 mM DH5a后，经1．0 融合蛋白，通过10％SDS．PAGE电泳，检测融合蛋白表达及可溶性。 合蛋白，通过GST 融合蛋白，然后进行1 白纯化情况。 西兰大白兔和大鼠进行免疫，取lml PBS(其中含有lmg抗原)和等体 积的完全弗氏佐剂乳化后在动物背部6个不同的部位进行皮下注射，每 只家兔每个部位注射约3009l抗原溶液，每只大鼠每个部位注射约30Itl 抗原溶液。每两周免疫一次，连续4次。首次免疫用完全弗氏佐剂，后 三次免疫用不完全弗氏佐剂。 (5)多克隆抗体的检测及纯化。通过蛋白斑点杂交试验检测免疫 动物血清中是否存在融合蛋白GST．eRF3b．37抗体。采用ProteinA亲和 层析柱对融合蛋白抗体进行纯化，纯化后的抗体运用间接ELISA法测定 的特异性。 结果： GSPT2．111基因片段11 分子质量为4．1kDa。 mMIPTG诱导，出 质粒pGEX．4T．1．GSPT2．111大肠杆菌DH5a经1．0 中文摘要 SefinoseTM 通过GST Re