三种砷化合物对康人淋巴细胞DNA损伤差异的研究.pdfVIP

中文摘要 目 的： ／ 砷是一种广泛存在于自然界的元素。砷化合物种类繁多，主 要包括无机砷 三价和五价 及有机砷 甲基砷和二甲基砷 。无 机砷进入体内在肝脏发生生物转化的基本过程为：无机五价砷 As7 一还原一无机三价砷 As“ 一甲基化一甲基砷酸 DMA” 一还原一二甲基亚砷酸 DMA“1 。砷酸盐还原酶、甲 基砷酸盐还原酶、二甲基砷酸盐还原酶、亚砷酸盐甲基转移酶、甲 基亚砷酸盐甲基转移酶、还原型谷胱甘肽 GSH 及s一腺苛甲硫 胺酸 SAM 参与此过程。过去认为，对人体造成危害的主要是三 价无机砷，砷在体内的代谢过程是其解毒过程。但目前的研究表 明，砷在代谢过程中产生的各种中间代谢产物对机体亦具有毒作 用。据报道MMA…具有比无机砷更强的毒性，活性极强的MMA“1 及DMAⅢ可能是砷化合物中诱发砷性癌症的主要物质。砷的甲基 化过程与原癌基因的激活及抑癌基因的失活关系密切。砷代谢过 程中可产生活性氧自由基 ROS ，攻击DNA，造成DNA单、双链 断裂，DNA一蛋白质交联以及DNA的碱性易损伤位点，即无嘌呤 无嘧啶位点 AP 的形成。大量流行病学调查资料表明，砷对于人 类是一种确定致癌物，砷暴露人群中肺癌、皮肤癌显著高发。砷与 DNA损伤之间关系的研究现已成为砷研究领域中的热点问题。 单细胞凝胶电泳技术 又称慧星试验 是一种目前广泛应用 于单细胞DNA损伤的检测技术。其主要原理为：细胞在裂解液的 作用下膜结构被破坏，细胞内成份扩散到裂解液中。DNA由于相 对分子量大而被留在原位。在碱性条件下，DNA发生饵旋，其中 的断裂片断和碱性易损伤片断被释放出来。在电场中泳动时，这 些片断可从核内溢出，形成与细胞核“头部”相区别的“尾部”。用 荧光染料标记后，在荧光显微镜下可呈慧星样外观。在一定范围 内，慧星的长度或荧光强度与DNA的损伤程度相关。该法快速、 灵敏、简便易行。广泛应用于DNA的损伤与修复，DNA一蛋白质 交联及DNA链间交联，遗传毒理学，肿瘤学，生物监测以及流行病 学等多个研究领域。j 7 本研究即是以慧星试验为检测手段，研究三种砷化合物对健 康人淋巴细胞DNA的损伤效应，即DNA链的断裂效应间是否存 在作用差异，并初步探讨砷化合物作用下诱导DNA链发生断裂的 机理。 方 法 f 1．淋巴细胞分离： 无菌抽取健康人静脉血20ml与等量RPMll640培养基混合， 缓慢加至等量淋巴细胞分离液上层。离心 3000r／min，30rain， 悬液体积为16ml。将细胞悬液加于24孔培养板，每孔lml，共加 16孔。送至二氧化碳培养箱培养 37℃，5％CO： 。待细胞稳定 30rain后开始施加处理因素，即Asm，As’及MAs’。每种处理因素 均分5个剂量组：1，5，10，20及50 pmaol／L。每个因素每个剂量做 1孔，每孔加药量为20／zl，同时设l孔空白对照组 加20止生理盐 水 。培养24小时后将每孔细胞悬液吸出，以胎盘兰法计算细胞 活力后将细胞悬液离心 1000r／min，10rain，4℃ 。将淋巴细胞以 液终体积为200斗1。 ·2· 2．慧星实验： 玻片预处理：1％普通熔点琼脂糖 NMA 201上1涂片，酒精灯 上迅速烤干。 100一滴于经过预处理的玻片，盖片， 第一层凝胶：1％NMA 将玻片置于冰排上，胶面向上，送4。C冰箱内固化10min。 第二层凝胶：取已制备好的细胞悬液200一，加l％低熔点琼 滴子已固化的第一层凝胶上，盖片。对照组及三种处理因素的每 个剂量组均做2个平行样。4。C冰箱内固化10min。 第三层凝胶：l％LMA85山滴于第二层凝胶上，盖片，4。C冰 箱内固化10min。 取下第三层盖片后立即将玻片浸入细胞裂解液中，在4℃冰 箱内裂解90min。取出玻片用滤纸擦干，在电泳液中浸泡30min 使DNA解旋后将玻片平铺于水平电泳槽 胶面向上 ，电泳20min 电流300mA，电压25V 。上述全部操作均需保持在4。C、暗光条 件下进行，以避免DNA发生额外损伤。电泳结束后将玻片取出， Tris中和3次，每次5min。 滤纸擦干，用0．4mol／L 用滤纸将玻片擦干后以40p．1溴化乙锭 50mg／L 染色，加盖 片后在荧光显微镜 G激发 下观察。对照组及三种处理因素的 每个剂量组均计数两张片子，每张片子计数50个细胞，即：对照组 及三种处理因素的每个剂量组均计数100个淋巴细胞。用目镜测 微尺以单盲法测定每个细胞的总慧星长度 Ixm 。以观测到的总 慧星长度的最小值及最大值为依据，按极差大小将全部观测值分 为五个组段，每个组段代表DNA损伤程度的一个级别 用罗马数 字I，II，III，IV