乙型肝炎病毒全基因扩增技术的建立及其在探讨宫内传播机理中的初步应用.pdfVIP

弟·军正上学曩士论文 乙型肝炎病毒全长基因扩增技术的建立 及其在探讨宫内传播机理中的初步应用 硕士研究生 李端 导 师 闰永平 徐德忠 摘 要 目的 乙型肝炎病毒 HBV 基因组具有很高的变异性，许多BBV携带者个 体内都存在不同的HBV基因株 即多样性或异质性 ，不同株的病毒复制水平、免 疫原性和传播特点等均不同，对疾病的发展和转归的影响也不同。为清晰的了解 HBV基因在母婴体内异质性的具体状况，探索HBV基因变异与富内传播的关系， 本研究建立了乙型肝炎全长聚合酶链反应 Full—lengthPCR ，可以直接从血清 中一次克隆HBV全基因。在此基础上，对llBsAg阳性孕妇及其新生儿体内BBV前 s／S基因进行了序列分析。 ， ：方法 ①2000年1月至6月收集西京医院检验科检测IIBVDN^阳性的乙型 肝炎患者血清lo例，提取鹏VDNA后，建立全长聚合酶链反应，并进行PCR条 件优化。 ②PCR产物回收纯化后克隆入载体，获得BBV全长基因克隆，同时用PCR、 酶切及测序三种方法对其进行鉴定。 ③1997～I998年，由王素萍博士收集太原市传染病院妇产科BBsAg阳性足月 分娩产妇静脉血及其新生几出生后24小时内股静脉血共50对。用新建立的HBV 全长扩增方法成功扩增fibsAg阳性孕妇HBVDNA共8例，其中发生宫内传播者4 例，未发生宫内传播者4例，并获得HBV全长基因克隆，然后对其前s／s区扩增 NTI软件。 并测序，其序列分析采用MEGLINE和VECTER ④从2例新生儿血清标本中提取BBVDNA，对其进行BBV前S／S区基因扩 1 l·军区土季|曩士*文 增并测序，结果与其母亲、其它HBsAg阳性孕妇以及临床普通乙肝患者体内 HBV基因的相应区段序列进行同源性比较分析。 结果；①HBv全长聚合酶链反应的建立：经全长PCR条件优化，PCR反应体 4．5u 3u l dNTPu 系为：10×Bufferl，25mMMgCl2l，lOn$i l，引物Pl、P2 p 合物加热至85℃后，加入酶反应混合物5 DNA混合酶2．6u， 1，包括Taq／[～o 10×Buffer 1分钟，72℃4分钟 每循环自动增加延伸时间5秒 ，40个循环后，72℃延伸 10分钟。用新建立的全长基因扩增方法。对lO份新鲜乙型肝炎患者血清标本扩 全阳性，同时以质粒为模板的扩增全部出现了目的扩增产物的核酸带。以相同样 本用该方法多次重复扩增，结果全长PCR目的产物带清晰。重复性稳定。获得的 HBV重组质粒用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定。均证明所获重组质粒为全长 船Ⅳ重组质粒。⑦用全长PSV扩增方法获得8例HBs^g阳性孕妇体内HBV全长 基因克隆，其中发生宫内传播和未发生宫内传播的孕妇各4例，每例选取5个全 长克隆．对其前s／s基因进行测序及序列分析。结果显示，所测克隆的核苷酸序 列均属于HBVC基因型。发生宫内传播的 lBsAg阳性孕妇的20个克隆中碱基平 均替代率为3．50％、缺失率为0．70％、插入率为1．21％，未发生宫内传播的HBsAg 阳性孕妇的20个克隆中碱基替代率为2．27％，缺失率为0．2096，插入率为0．26％， 三种突变模式中以替代最为常见。对两类各20个克隆的碱基平均突变率做f检 验，f值为11，P O．001，有较为显著的差异。HBV前s／s区各克隆间的核苷酸 变异亦显示，发生宫内传播的HBsAg阳性孕妇体内5个克隆间核苷酸变异较大． 对两类耶sAg阳性孕妇每例5个克隆间的平均同源性作t检验，t值为2．92， DNA前S／S区进 P O．05，有统计学意义。③对2份硒sag阳性新生几血清HBV 行扩增并测序。所测序列与已获得的其l诏sAg阳性母亲5株全长基因的相应区段 2 摹-罕正土季硕士静文 孕妇体内FIBV全长基因相应区段序列同源性比较，结果分别为79．9～92．796、 应区段序列同源性比较，结果分别为84．I～92．6％、85．6～91．7％。， ／ 结论：①|IBV全长聚合酶链反应目的产物带清晰，重复性稳定，所获i-IBV全 长克隆经PCR、酶切、测序三种方法鉴定，均证实为HBV全长克隆、表明HBV全 长基因扩增技术的建立是成功的，但这种方法更适用于对高拷贝模板的扩增。② 发生宫内传播的孕妇较未发生宫内传播的孕妇体内腿V前S／S区基因异质性高， 碱基突变率亦显著增高，说明孕妇体内Imv基因异质性增高可能较易发生宫内传 播。③新生儿体内 珀Ⅳ前S／S基因与其l-ISsAg阳性母亲体内全长基因相应区段 序列同源性高于与其它HBsAg阳性孕妇和临床普通乙肝患者体内FIBV全长基 因相应区段序列同源性，说明新生儿体内HBV来源于