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微囊藻毒素与原发性肝癌的关系研究 中文摘要 [ 目的] 利用RNAi 技术沉默XRCC1 基因，测定微囊藻毒素-LR 对BRL-3A 细胞增 殖和DNA 损伤的影响，探讨XRCC1 在微囊藻毒素致损伤修复中的作用。通过 流行病学调查，探讨福建省福州地区饮水类型、炎性体信号通路相关miRNA 多 态性与原发性肝癌的关系。 [方法] 1 RNAi 技术沉默BRL-3A 细胞XRCC1 的表达，通过荧光定量PCR 检测转 染后12h、24h 及48h XRCC1 的表达变化。 2 分别以0、2 、6、10µg/ml MC-LR 染毒XRCC1 沉默的大鼠肝细胞、正常 大鼠细胞及错义siRNA 转染的细胞4h 、8h 和16h，用CCK-8 试剂盒检测大鼠肝 细胞增殖与凋亡情况。 3 分别以0、2 、6、10µg/ml MC-LR 染毒XRCC1 沉默的大鼠肝细胞、正常 大鼠细胞及错义siRNA 转染的细胞4h 、8h 和16h，用荧光定量PCR 检测PARP-1 表达量的变化。 4 分别以0、2 、6、10µg/ml MC-LR 染毒XRCC1 沉默的大鼠肝细胞、正常 大鼠细胞及错义siRNA 转染的细胞，同时，利用MMS 为阳性对照，以相同的浓 度梯度对正常大鼠细胞染毒16h，进行彗星实验。 5 采用病例对照研究，收集病人226 例，对照235 例，通过问卷调查获取生 活饮食等信息，应用logistic 回归模型，评价肝癌的危险因素，并计算OR 及其 95%可信区间。 6 应用分子流行病学研究方法，采用两阶段病例对照设计，采集病例与对照 的外周血，提取DNA ，以MALDI-TOF-MS 质谱检测技术对炎性体信号通路相 关microRNA 多态性进行检测，用非条件Logistic 回归模型计算基因多态性与肝 癌风险的OR 值及其95%可信区间。 [结果] 1 瞬时 RNAi 技术成功抑制 XRCC1 的表达，在转染 12h、24h 及 48h 后 3 XRCC1 的抑制效率分别为34.5%、64.4%及62.9% 。 2 染毒 2µg/ml 时，三组细胞三个时间点的细胞增殖活性差别不具统计学意 义。染毒6µg/ml，染毒16h 后，siRNA-XRCC1 组细胞增殖活力与正常细胞组相 比，差异具有统计学意义。染毒剂量10µg/ml，染毒8h 和16h 后，siRNA-XRCC1 组细胞增殖活力与两个对照组相比均有统计学差异，细胞增殖活力均降低。 3 染毒MC-LR 2µg/ml 4h 时，相比两个对照组，siRNA-XRCC1 组 PARP-1 表达量增加；染毒 2µg/ml 时，siRNA-XRCC1 组 PARP-1 随着染毒时间延长， PARP-1 表达量下降；染毒4h 时，siRNA-XRCC1 10µg/ml 组PARP-1 表达量相对 于siRNA-XRCC1 2µg/ml 组降低。 4 各剂量组与本细胞组 0µg/ml 组相比，尾距增大，且差异具有统计学意义 （P0.05 ）。siRNA-XRCC1 组无论与正常细胞组还是与错义 siRNA 组相比较均 有差别，说明XRCC1 沉默细胞对MC-LR 的毒性更敏感。阳性对照组各剂量组 与 0µg/ml 组相比，尾距的差异亦有统计学意义，说明本次彗星实验成功，条件 不存在问题。 5 多因素 logistic 回归分析得肝癌的危险因素：乙肝病史（OR=164.799 ）、 饮用沟塘水（OR=8.750 ）；保护因素为饮用泉水（OR=0.136 ）、深井水（OR=0.028 ）、 喝茶（≥1 次/ 天）（OR=0.143 ）、吃粗粮 1 次及以上（OR =0.031, OR =0.034, 1 2 OR =0.012 ）。 3 6 共显性模型下，rs2168709 GG 携带者肝癌危险度是携带TT 或TG 携带者 的1.