志贺菌属细菌整子与多重耐药性研究.pdf

摘要 摘要 志贺菌属($hfgeHa)是感染性腹泻的重要病原，它引起的细菌性痢疾(菌 痢)发病率在我国居传染病发病率的前三位，是我国传染病防治工作的重点。 抗生素应用于临床治疗菌痢历史已久，不仅可以减轻病情、缩短病程，还能减 少病人排菌，避免进一步传播。然而随着抗生素的广泛使用，临床频繁出现耐 药志贺菌属菌株，而且呈现为多重耐药(multi．drugresistance，MDR)。多重耐药 志贺菌引起的感染不仅在发展中国家，在发达国家也成为影响临床治疗的关键 因素。多重耐药志贺菌属不仅给细菌性痢疾的防治带来新的挑战，对细菌耐药 性的传播也产生重要影响。因此，志贺菌属细菌的多重耐药问题和耐药机制引 起了人们的广泛关注。 志贺菌属获得某种抗生素抗性主要通过两种机制，一是细菌自身染色体基 因发生突变，如抗生素靶位点的突变、调控基因突变引起膜蛋白表达的异常或 主动流出泵系统的激活等，使细菌对抗生素从敏感变成抗性；另一机制则是细 菌从外部获得耐药基因，即耐药基因的水平转移，这是目前人们认为临床多重 耐药株产生的主要原因。许多可移动基因单元如质粒、转座子等，携带抗生素 耐药基因，使得耐药基因在细菌属、种、株间传播，加快了耐药菌株的形成。 近年发现整合子系统参与耐药基因的传播。整合子包括整合酶、基因盒和特异 性重组位点，整合酶可以不断地从周围环境捕获耐药基因盒或从整合子上切除 基因盒。整合子作为一种遗传元件，它自己不能自由移动，但它可以位于质粒、 转座子或者染色体上，通过其他可移动元件，整合子促进了耐药基因的扩散， 自身的广泛分布与肠道菌多重耐药性的形成有关。研究表明，含有整合子的细 菌菌株比不含有整合子的菌株更多的显示出对不同抗生素的耐药性，整合子一 基因盒系统与志贺菌属多重耐药性有关。国内外对志贺菌属整合子的研究发现 多重耐药志贺菌携带2类整合子多见，而1类整合子检出率相对较低。对于耐 药基因盒类型而言，在志贺菌属中发现的类型相对较单一。不论整合子的类型 还是携带耐药基因盒的种类，都与志贺菌属菌株的多重耐药表型没有一～对应 关系。因此，探索整合予．耐药基因盒系统与志贺茵属多重耐药的关系、评价其 在志贺菌属细菌多重耐药机制中的作用和地位是十分必要的。 本研究对临床分离的83株福氏志贺菌和7株宋内志贺菌进行抗生素敏感性 I 摘要 测定，比较不同类型整合子及耐药基因盒在志贺菌属的分布、构成差异，并对 典型整合子．耐药基因盒系统进行克隆和功能分析，以期了解整合子．耐药基因盒 系统与志贺菌属多重耐药性之间的关系、正确评价整合子．耐药基因盒系统在志 贺菌属多重耐药机制中的作用和地位。 方法 1药敏实验 用纸片扩散法(discdiffusion test)测定所有菌株对以下抗生素药敏纸片的 唑林(CFZ)。采用琼脂稀释法测定以下抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibition 氧苄啶(TMP)和磺胺异嗯唑(sss)。 2 PCR方法检测整合子的整合酶基因PCR．I疆LP分析整合子的可变区基因 分别针对1、2、3类整合子的整合酶基因设计引物，煮沸法提取菌株总DNA 进行PCR扩增检测整合酶基因。用试剂盒分别提取菌株的基因组DNA和质粒 类整合子的可变区引物hep58．ISVR、针对2类整合子的可变区引物 hep74-hepSl，进行整合子的可变区基因PCR扩增检测。选用合适的限制性内切 酶，对得到相同长度大小的PCR产物进行RFLP(restrictive fragmentlength polimorphism)分析，得到相同内切酶图谱的片段被认为是序列相同的片段。 3 Southern杂交 DNA andDection) 按Roche公司地高辛标记和检测试剂盒(DigLabeling 的操作说明书进行操作。首先将整合酶基因intl1和intI 2的PCR产物经凝胶 回收纯化后定量，用随机引物法获得地高辛标