环境雌激素体外检方法--E-SCREEN法的建立和应用.pdfVIP

环境雌激素体外筛检方法—— E-SCREEIII法的建立和应用 浙江大学医学院 硕士研究生 常艳 导师朱心强黄幸纾 摘要 f_胁 近年来，有关环境内分泌干扰物对生态环境、野生动物和人类健康潜 ，， 在危害的问题深受重视。f在众多的环境内分泌干扰物中，具有雌激素样作 ＼ 用的化合物占了绝大多数，已经发现的环境雌激素样物质就有上百种，而 且在目前常用的数万种化合物中可能还有相当一部分具有雌激素样作用。 环境雌激素的种类繁多，结构各异，因此很难仅从其结构上判断某物质是 否具有雌激素样作用，也没有一种单一的化学分l旰方法能检测所有这些环 境雌激素样物质。 而采用传统的整体动物试验方法来研究，又将耗费大量 的人力、物力、财力和时间。因此有必要建立快速，敏感、简便、经济的 体外筛检方法。人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖法(简称E-SCREEN法)具有 敏感性高、快速、简便、可靠等优点，被认为是筛检环境雌激素的理想方 i 法之～。1本研究的目的是建立该方法，并用以检测硫丹等化合物的雌激素 ／ · 样作用。 ，? ／2材料与方法 t 2．1细胞株和培养条件 BUS细胞株，以含5％ 雌激素敏感、雌激素受体阳性的人乳腺癌MCF-7 胎牛血清的DMEM培养液培养传代。培养条件：37C、6．7％C02／93．3％空气、 相对湿度95％±5％。 2．2人血清中雌激素的去除 健康成年男性血清经56C水浴热灭活后备用。经酸洗的活性碳在临用 r。。前用蒸馏水洗两次，制各5％碳一o．5％葡聚糖T7。悬液。取与血清等体积的碳 葡聚糖悬液，经600rpm离心5min后去除上清液。加入血清与碳葡聚糖颗 粒混匀。将此血清一碳葡聚糖混合液置37X3下1小时，并以6转／rain摇动 以保持混悬状态．使血清与碳充分接触。然后以3000rpm离心20min，吸 11微孔滤膜抽滤。去除雌激素的血 出上清并重复离心一次。上清液用0．22 清置一20℃保存备用。 2．3人氛腺癌细胞体外增殖试验法 普通培养的MCF一7细胞经消化液消化后分置96孔细胞培养板中，贴壁 24后去除原培养基，换成试验用培养基：无酚红的DMEM培养基加10％热灭 活的去雌激素人血清。继续培养5天，此时可以加入不同浓度的受试物和 20u hr。 l，继续培养4 阳性物雌二醇。第六天每孔加入5mg，ml的MTT u 150l的二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪在 吸去孔中的培养液，每?L自nA 550rim波长处比色，颜色深度与活细胞数呈正比。 2．4评价指标 分别以增殖效应(PE)、相对增殖力(RPP)、相对增殖效应(RPE)和 半数有效浓度(EC；。)来评价化合物的雌激素活性。 3结果 所有化合物均以无水乙醇作为溶剂，且无水乙醇在培养液中的终浓度 不得超过0．1％。阴性对照为含0．1％无水乙醇的无酚红的DMEM培养液。试 验中各浓度的无水乙醇均不能诱导MCF一7细胞增殖，说明无水乙醇本身无 雌激素活性，可以作为溶剂和阴性对照。 101 雌二醇的晟低检测浓度为1X 3M(p=O．001)，诱导细胞最大增殖的