海普诺(HP )改善He pG2细胞胰岛素抵抗作用的研究.pdfVIP

摘 要 目的 本课题通过高糖高胰岛素诱导HepG2 细胞建立胰岛素抵抗模型，探究海普 诺(HPN)对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响，和对胰岛素抵抗HepG2 细胞内蛋白水平及磷酸化水平改善作用，并初步探讨可能的分子生物学机制，为 HPN 的进一步的开发利用提供实验依据。 方法 1. 用 Cell Counting Kit-8 （CCK-8 ）法研究不同浓度的 HPN 对肝癌细胞株(HepG2) -7 -4 细胞活性的影响。体外培养 HepG2 细胞，CCK-8 法检测浓度为（1×10 ～1×10 mol/L ）的HPN 作用HepG2 细胞后24 h，36 h 和48 h 的存活率。以及在倒置显微 镜下观看各个浓度的HPN 作用HepG2 细胞48 h 细胞形态的变化。 2. 胰岛素抵抗 HepG2 细胞模型的建立。实验设立对照组和模型组，将含有胰岛素 培养液中培养的 HepG2 细胞作为模型组，不含胰岛素的培养液中培养的 HepG2 细 -7 胞为正常对照组。以浓度为 30 mmol/L D- 葡萄糖和不同浓度的胰岛素（1×10 ～ 5×10-6 mol/L ）的培养基培养HepG2 细胞72 h ，后换正常的培养基持续6 h 后检测 细胞上清液中葡萄糖消耗量，以确定高糖高胰岛素诱发的 HepG2 细胞胰岛素抵抗 造模最佳胰岛素浓度。 3. 胰岛素抵抗模型建立以后，用不同浓度的 HPN 作用胰岛素抵抗 HepG2 细胞 6 h，用多功能自动生化仪葡萄糖- 己糖激酶法检测不同浓度的HPN 对 HepG2 细胞上 清液中的葡萄糖消耗量的影响。 4. 蛋白免疫印迹法（Western blot ）检测HPN 处理的胰岛素抵抗HepG2 细胞6 h 后 细胞内 PTP- 1B，IRS- 1，Akt 蛋白的蛋白水平以及 IRS- 1(Tyr612)酪氨酸磷酸化， Akt （Ser473 ）丝氨酸磷酸化水平。 结果 1. CCK-8 结果显示在低浓度时 HPN 促进 HepG2 细胞增殖的作用，细胞活性与 HPN 浓度的呈负相关，并对时间的依赖性不明显；倒置显微镜下观看细胞形态及 -4 数量有明显改变，尤其在HPN 浓度为1×10 mol/L 时。 2. 高糖和高糖高胰岛素均能诱导 HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的建立，诱发 HepG2 -6 细胞胰岛素抵抗造模最佳胰岛素浓度为 1×10 mol/L ，D- 葡萄糖浓度为 30 mmol/L 。 -8 -7 3. 在胰岛素抵抗 HepG2 细胞中，在 HPN 浓度为 5×10 ～1×10 mol/L 时都能促进 -7 胰岛素抵抗 HepG2 细胞葡萄糖消耗（P0.05 ），尤其当 HPN 浓度为 1×10 mol/L 时，能显著促进胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗（P0.01 ）。 万方数据 4. 经Western Blot 结果检测显示，经HPN 处理的胰岛素抵抗HepG2 细胞中较模型 组 PTP- 1B 蛋白表达水平有明显的下降，IRS- 1 蛋白表达水平有明显升高，而 IRS-