甲型肝炎病毒T84株单克隆抗体的研制及应用.pdfVIP

中文摘要 甲型肝炎病毒TZ84株 单克隆抗体的研制及应用 ／ 捅 要 ， p l 北唐山一位甲肝病毒感染者粪便中分离的，适应于在人 胚肺二倍体细胞2BS株上培养。目前已将该株病毒作为 生产用毒种研制成功甲肝灭活疫苗。本羹验的目的是用 甲肝病毒TZ84株接种人胚肺二倍体细胞2BS株制备的甲 肝抗原免疫BABL／C小鼠，采用杂交瘤技术建立能稳定 T￡E}F}￡lI}lIl§E￡fl}F#§}}lI}}|}}l}；!；}} 分泌甲肝病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；通过对杂交 瘤细胞及其单抗的分析鉴定，得到特异性的并且与抗原 结合位点不同的甲肝病毒单克隆抗体；将抗原结合位点 不同的单抗进行组合，用做试剂的包被和酶标记物来代 替多抗，以制备抗体和抗原检测试剂。 f方法：将经甲肝抗原免疫的BABL／c小鼠脾细胞与骨 髓瘤细胞Sp2／0进行融合，经HAT培养基选择培养，用 间接ELISA法进行杂交瘤细胞筛选。抗体阳性细胞经连 续3次克隆后，建立稳定分泌甲肝病毒单克隆抗体的杂 交瘤细胞株。 杂交瘤细胞经秋水仙素处理、低渗处理、固定、制 片、染色、显微镜观察染色体形态并计数进行染色体分 析。采用ELISA法测定单抗的Ig类别及皿类。根据抗体 结合抗原达饱和的时间用间接ELISA法测定单抗的相对 亲和力。细胞连续传代三个月及液氮冻存后复苏，不同 niJ-i‘司取其培养液上清，用间接ELISA法检测其抗体效价， 测定抗体分泌的稳定性。 采用双抗体夹心法通过与3株其它甲肝病毒和乙肝 病毒的交叉反应，对单抗的特异性进行测定。将小鼠腹 水用辛酸一硫酸铵法提纯、用HRP标记后，通过ELISA 法抗体阻断试验对抗原的结合位点进行分析。将单抗与 等量不同稀释度的甲肝病毒混合，于37*(2作用2小时。 然后接种长成单层的2BS细胞，培养、收获、反复冻融 后，采用ELISA双抗体夹心法定性检测甲肝抗原，通过 计算TCID如对单抗的中和活性进行测定。 根据单抗分析鉴定的结果，将不同位点的单抗组成 甲肝抗体和抗原检测试剂，代替现有试剂中的多抗，通 过对真实性、可靠性等的测定，对单克隆抗体的应用进 行初步研究。 结果：通过对甲肝抗原的包被浓度、酶标二抗的使用 浓度和封闭条件的选择，建立了杂交瘤细胞的筛选方法， 即使用纯化甲肝抗原l：50包被，酶标二抗使用浓度为 l：10000，用含lO％牛血清的PBS进行封闭。对连续3 次克隆的杂交瘤细胞用间接ELISA方法进行筛选，建立 了7株稳定分泌甲肝病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 经鉴定，杂交瘤细胞的染色体数为98～106条，所 获得的分泌抗体的细胞为杂交瘤细胞。用ELISA法鉴定 单克隆抗体免疫球蛋白的类和亚类，5株为IgG2a、l株 对亲合力，2株为45分钟，3株为60分钟，2株为120 2 强。；叛ig淌幽豁蜮滋黼澄鬣黼涵函鹾函豳琵翦鏊蓬燧，；鬣 分钟。杂交瘤细胞连续传代三个月，分泌抗体的能力稳 定：液氮冻存一个月后复苏，对细胞上清进行检测，抗 体仍为阳性。 通过与其它株甲肝病毒和乙肝病毒的交叉反应对单 克隆抗体的特异性进行分析，所获得的单抗与其它3株 甲肝病毒反应，而与乙肝病毒不反应，为特异性单抗。 将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠制备腹水，检测杂交瘤细胞 上清和腹水的抗体效价，分别为l：40～l：10240和105～ 108。腹水提纯后，抗体效价为102～106，单抗的纯度可 达94．99％。再将提纯后的抗体用辣根过氧化物酶(HRP) 进行标记，其使用浓度为1：800～l：51200。通过ELISA 法抗体阻断试验对单抗结合抗原的位点进行分析，7株单 抗分别识别3个不同的抗原位点，但3个位点存在一定 的相关性。用单抗腹水去中和甲肝病毒后，接种长成单 层的2BS细胞，有l株单抗具有较强的中和甲肝病毒感 染性的能力，中和指数为2．67。 3株不同位点的单抗组成的试剂，用于甲肝抗体检 测时，其阳性检出率高于现有多抗试剂的阳性检出率， 与雅培试剂检测结果符合很好，因此，可用于对疫苗的 免疫效果进行评价：用于甲肝抗原