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第三章 蛋白质 第三章 蛋白质 3.1 氨基酸、多肽和蛋白质 3.2 氨基酸 3.3 多肽 3.4 蛋白质 3.5 蛋白质的结构 3.6 多肽的化学合成 3.5 蛋白质的结构 一级结构，指蛋白质分子中的氨基酸的排列顺序。 二级结构，指蛋白质多肽链的主链骨架中的若干肽段的构象排列。 三级结构，指多肽链在二级结构的基础上，各原子的空间排布，包括侧链基团的取向，是二级结构的基础上范围更广的盘旋和折叠。 四级结构，是指多条肽链组成的一个蛋白质分子时，各亚单位在寡聚蛋白质中空间排布及亚单位间的相互作用。 3.5.1 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序（蛋白质生物功能的基础 ） 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 意 义 研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能。 一级结构的研究为生物进化提供了依据， 不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。 一级结构的研究为一些分子病的诊断提供了依据。 只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。 镰刀状细胞贫血病（血红蛋白分子病） 蛋白质的一级结构 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序（蛋白质生物功能的基础 ） 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 二硫键 二硫键 蛋白质一级结构的测定 蛋白质一级结构测定的一般步骤： 确定多肽链的数目 测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系可确定多肽链的数目 拆分多肽链 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 测定多肽链的氨基酸组成 酸水解成多肽，并计算出各种氨基酸的分子比 测定多肽链的氨基酸顺序 多肽链的氨基酸顺序分析 多肽链的选择性降解 酶解法（利用某些蛋白水解酶，进行选择性降解。） 化学法（溴化氰水解法：切割甲硫氨酸（Met）的羧基形成的肽键） 多肽链末端氨基酸测定 鉴定N-端氨基酸： ?? 二硝基氟苯（DNFB）法又称Sanger法 ?? 丹磺酰氯法（DNS）法 ?? Edman氨基酸顺序分析法(多肽氨基酸顺序自动分析仪) 鉴定C-端氨基酸： ?? 肼解法 酶解法 溴化氰水解法 选择性地降解由甲硫氨酸的羧基形成的肽键 二硝基氟苯（DNFB）法 Sanger法： 2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 丹磺酰氯法 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1×10-9mol。 Edman氨基酸顺序分析法 Edman氨基酸顺序分析法 （1）耦联 Edman氨基酸顺序分析法 （2）裂解 Edman氨基酸顺序分析法 （3）转化（ATZ不稳定，转化成PTH-aa) 多肽氨基酸顺序自动分析仪 仪器原理：Edman法。 1967液相测序仪：旋反应器，适于大肽段。 1971固相测序仪：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981气相测序仪：用Polybrene反应器。 肼解法 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 练习 根据以下实验结果,推断一条多肽链的氨基酸顺序. 1).酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser. 2).羧肽酶A水解得:Ala. 3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg. (2).Lys;Phe;Ser. (3).Lys. (4).Ala;Met;Ser. 4).溴化氰裂解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser. (2).Ala;Ser. 5).嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;Ser. (2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser. 1).酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser. 2).羧肽酶A水解得:Ala. 3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组