体外培养小鼠小Cajal间质细胞及理中丸对该细胞的作用机制.pdfVIP

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体外培养小鼠小Cajal间质细胞及理中丸对该细胞的作用机制

成都中医药大学硕士论文 中文摘要 目的:研究体外培养小鼠小肠Cajal 间质细胞的方法,并探讨理中丸对该细胞体外作用机制。 方法:结合酶消化法和密度离心法分离、培养原代小鼠小肠ICC ,从防止污染、维持体外ICC 功能、促进ICC 生长和维持细胞表型等方面探讨影响体外分离、培养ICC 的关键因素;体外 观察ICC 特征,生长曲线进行描述,c-kit 免疫荧光鉴定;按照理中组、四君子组、吗丁啉组 及空白组分组,选取对数生长期ICC 给药;从细胞周期、Ca2+ 检测的角度探讨理中丸对ICC 的机制。 结果:⑴c-kit 在体外 ICC 胞体、轴突上呈现阳性表达,提示体外培养ICC 成功;⑵MTT 法 测细胞增殖:①含药血清法:各组均与空白血清组有显著性差异(P0.01 ),其中吗丁啉组 (15%)最明显;理中丸组10%,15%浓度有促进增殖作用, 20%浓度组对体外ICC 呈现抑 制倾向;四君子组 (10%,15%,20% )均也表现出对 ICC 的增殖作用,但呈量-效的反相关 系;②直接给药法:理中中、高组以及四君子低、中组与空白组比较均有显著的统计学意义 (P0.01 ),有促进增殖作用,其它组则无统计学意义;⑶.流式细胞仪检测细胞周期:①含药 血清法:各组均优于空白组,各组的ICC 的S 期增加以理中15%组最显著,理中10%、15% 组与均优于吗丁15%组;②直接给药法:各组S 期均较优于空白组,其中理中中、高剂量组 优于吗丁组;⑷Fluo-3AM 染色体外ICC Ca2+ 的提示:体外培养小鼠小肠ICC 振荡约为22.5 次/min,振幅规律:87.734 ±5.349 。理中丸含药血清法的频率、振幅是 25 次/min ,89.078 ± 5.730 ;直接给药法的频率、振幅是:24.5 次/min ,88.842 ±5.966 。比较空白组均稍有增加, 但都无统计学意义(P ﹤0.05) 。 结论:⑴ICC 的体外培养成功与否,极大的影响了该细胞深入研究。例如避免污染、缩短分 离操作时间、增加一次原代取材细胞数量、提高活细胞数量、增加贴壁率、合理换液时间以 及添加外源性SCF (是稳定细胞表型和促进ICC 生长的关键)等本课题在前人基础上,结合 实践的心得;⑵体外培养小鼠小肠ICC 接种24h 后,即可贴壁,细胞最初呈三角形或梭形,并 有少量短突起。72h 并与周围细胞形成网络状突起连接。体外培养7d 可以伸出二、三级突起, 形成较复杂的网状连接。根据生长曲线图可知,体外培养ICC 细胞1~3d 出于滞留期, 7~ 4 成都中医药大学硕士论文 8d 左右为对数生长期,适合给药;⑶结合细胞增殖和细胞周期检测结果推测:①含药血清法: 理中15%组含药血清能明显促进ICC 的分裂,提高增殖率和细胞数量;理中20%组的增殖率 和增殖数都介于吗丁啉组和空白组之间,促增殖作用力明显减弱;②直接给药法:理中低剂 量组与空白组比较无统计学意义,理中中、高剂量组促进ICC 分裂、提高增殖率均优于空白 组、吗丁组。以上提示,理中丸在一定浓度、剂型方式上能调节细胞周期,促进细胞增殖分 裂;⑷Fluo-3AM 染色从功能角度证实理中丸有轻度影响体外培养 ICC 的Ca2+振荡的频率、 振幅等的趋势 (但无统计学意义)。 关键词: 体外培养 Cajal 间质细胞 理中丸 c-kit 5 成都中医药大学硕士论文 ABSTRACT Objective : To investigate the technology of cultur ing interstitial cells of Cajal(ICC) in vitro, and to observe the mechanism of action of lizhong pills to ICC. Methods : Enzymatic digestion and ficoll

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