绞股蓝皂苷微生转化及其有效成分对NSCLCA549细胞增殖的抑制作用.pdf

摘要 毒，止咳祛痰功能。绞股蓝中的皂苷类化合物绞股蓝皂苷L、绞股 蓝皂苷LI、 达木林A以及达木林B具有很好的抗肿瘤活性，备受 国内外科研工作者的关注，但它们在绞股蓝中的含量甚微。因此，需 要寻找有效的方法获得更多的此类化合物。微生物转化方法具有显著 的位置选择性和立体选择性，能完成一些用化学方法难以进行的生化 反应，同时具有与人类类似的代谢酶等特点，被用来模拟药物在体内 的代谢行为，从中分离和鉴定人类或动物体内微量或痕量的代谢产 物。因此，微生物转化方法己成为天然产物结构修饰和体内代谢研究 的重要手段之一。为了探讨绞股蓝抗肿瘤的药效物质基础，了解绞股 蓝皂苷在生物体与大鼠体内的代谢，本论文对绞股蓝提取物进行了不 同微生物的转化，并采用LC／MS．IT-TOF与现代光谱技术对绞股蓝皂 苷的微生物转化进行了深入研究。同时，检测绞股蓝微生物转化前后 cell 的主要成分对非小细胞肺癌(Non-small luIlg A549细胞增殖的影响。采用德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、 枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种及节杆菌等5种细菌，绿色木霉、 黑曲霉、梅林青霉、长枝木霉、分枝犁头霉及雅致小克银汉霉6种真 菌以及酵母菌作为发酵菌种，利用液体摇培法对绞股蓝皂苷进行微生 物转化，确定各微生物对绞股蓝微生物转率：选取黑曲霉为代表菌种， 运用单因素法确定转化的最佳条件(时间、温度、转速)；在筛选结 果的基础上，大量富集绞股蓝德氏乳杆菌保加利亚亚种转化产物，采 用硅胶柱色谱及半制备型高效液相色谱方法，从中分离有效成分；通 过UV、MS、NMR等波谱技术，鉴定有效成分的结构；采用德氏乳 杆菌保加利亚亚种对绞股蓝主成分gypenosideⅪ，Ⅵ进行转化，初步 探索微生物转化的机制；采用LC／MS．IT-TOF方法，分析绞股蓝提取 物在大鼠体内的吸收和代谢产物；运用CCK-8法检测绞股蓝微生物 转化前后主要成分对A549细胞增殖的抑制作用。结果表明，(1)黑 曲霉、分枝犁头霉、德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、酵母菌、 雅致小克银汉霉、节杆菌、枯草芽孢杆菌亚种、枯草芽孢杆菌、绿色 木霉、梅林青梅以及长枝木霉12个菌种对绞股蓝皂苷反应前后转化 28℃、转速200r／min、反应时间3d。(3)从转化前绞股蓝中分离得 到2种达玛烷型皂苷，被鉴定为绞股蓝皂苷ⅪⅣI(gypenosideXI．fⅥ) 和绞股蓝皂苷LⅥ(gypenosideLⅥ)；经德氏乳杆菌保加利亚亚种转化 后的绞股蓝产物中分离得到4种达玛烷型皂苷，分别被鉴定为达木林 A(d锄ulinA)、达木林B(d锄ulinB)、绞股蓝皂苷L(gypenosideL)以 XLM 及绞股蓝皂苷LI(gypenosideLI)。(4)绞股蓝皂苷gypenoside 经德氏乳杆菌保加利亚亚种转化，通过脱糖基及脱水反应，生成绞股 蓝皂苷L、绞股蓝皂苷LI、达木林A及达木林B。(5)给SD大鼠灌 胃绞股蓝提取物，绞股蓝皂苷LⅥ、绞股蓝皂苷ⅪⅣI、绞股蓝皂苷L、 绞股蓝皂苷LI、达木林B及达木林A均被吸收入血，并以尿液排出 体外。(6)CCK．8法显示，微生物转化后的4个皂苷类化合物绞股蓝 皂苷L、绞股蓝皂苷LI、达木林B及达木林A具有较强的A549细胞 士O．11、19．15土O．04岭／mL，而微生物转化前的主成分绞股蓝皂苷 ⅪⅣI和绞股蓝皂苷LⅥ的IC50值大于100舢。因此，微生物转 化法是一种从天然产物中获得更强药理活性成分的有效途径，同时是 药物体内吸收及代谢研究的重要方法之一。 关键词：绞股蓝，微生物转化，达玛烷类皂苷，A549细胞增殖抑制 作用 IlI ABSTRACT hasa胁ction 6咖伽据聊聊口pP玎鲫哟加“朋(11hlulb．)Mal【inoof heat andtoXicmat|erials五}Iom away