重组DNA导入受体细胞要点.ppt

第六章 重组DNA导入受体细胞的方法 1.DNA导入细菌的方法 2.DNA导入酵母的方法 3.DNA导入植物细胞的方法 4.DNA导入动物细胞的方法 转化 转染 转导 接合转移 1.重组体导入细菌细胞 （1）大肠杆菌 重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation)。 转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。 化学诱导感受态法 电转化 感受态细胞（competence cell）是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。 ★ ★ I. 化学诱导感受态法 原理：E.coli 细胞处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物进入细胞，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到106～108转化子/?gDNA。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 感受态细胞制备 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备。 CaCl2处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 储存感受态菌要在-70℃以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用 10ng质粒DNA 100?L感受态菌 冰上混合，静置10分钟 42oC 1分钟 冰浴2min，加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA 转化过程 II.电转化 可以转化大分子DNA（50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后电转化 电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。 原理:利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔( electroporation) ,形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到109～1010转化子。 电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡时，转化效率达到最高。 ★ LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，4℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 4 ℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 4 ℃离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 细胞分装成50?L 电转仪调为2.5kV, 25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA 混合、冰浴 加入1mLSOC培养液 37°C中速震荡60分钟 涂布 转化 细胞制备： 电转化： 用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上 一般电穿孔转化须在低温下（0～4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。 由于细菌细胞相对较小，因此与 DNA导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以20～40μl为宜。 磷酸钙-DNA共沉淀法：简称磷酸沉淀法，属于转染法，能把外源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但转染效率远远不如体外包装法（转导）。 　　 HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞。 对数生长期的细菌和重组λ噬菌体磷酸钙-DNA沉淀混合，