细胞培养的准备.ppt

实验二 细胞培养的准备 本次课内容 掌握：细胞培养无菌间的基本要求，各种相关设备的使用方法，培养器械清洗和消毒，用液灭菌的方法。 熟悉：细胞培养用液的配制方法，血清的灭活方法，各种用液的分装和保存原则。 了解：细胞培养准备阶段的重要性。 细胞培养的关键 1、无菌——核心 2、培养条件 一、细胞培养的必备设施 （一）无菌实验室 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 使用前，紫外照射（30分钟-1小时）；使用后可紫外照射10min左右；人员进出要更衣。 平时：每日用紫外照射1-2小时；每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 超净工作台使用流程和注意事项 1、使用前，70%（或75% ）酒精擦拭，将培养用品从传递窗进入工作台（有菌的放进污物传递窗，特别检查酒精灯、棉球、镊子、废液缸；有生物活性的从冰箱中取出，放在洁净窗，复温） 2、开启超净台内紫外灯照射30min-50min，同时开启无菌间的紫外灯。 3、操作者准备：头、脸、手。进入无菌工作间，关超净工作台紫外灯，将实验其他用品拿进工作台。 4、开超净台日光灯和风机，预工作2-5min，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态； 5、使用时，任何中途进入超净工作台的物品必须用酒精消毒表面，包括操作者的手。 6、使用完毕后，要用酒精将台面和台内四周擦拭干净，并用紫外照射5分钟以上，以保证超净台无菌。 操作时 注意：物品要归类摆放，防止污染 1．动作要轻，不能太快，以免搅动空气增加污染；玻璃器皿也应轻取轻放，以免破损污染环境2．操作应在近火焰区进行。3．接种环、接种针等金属器材使用前后均需灼烧 4．工作结束，收拾好工作台上的样品及器材，最后用消毒液擦拭工作台。 5．操作过程中，所有带进的器皿表面，必须擦拭。 （三） CO2培养箱 通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，如稳定的温度（ 37±0.5℃ ）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（95%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。 CO2培养箱：水套式、气套式 CO2培养箱的灭菌：HEPA高效滤器能过滤培养箱内空气，可过滤除去99.97%的0.3um以上的颗粒 （三） CO2培养箱 使用注意事项： 1、开关门人员手部需消毒、动作快速 2、培养物是开放培养。 3、定期向增湿盘中补充无菌水。 4、长期不使用，开机后必须有一定时间缓冲期，并用消毒液擦拭内表面。 (四)其他设备 倒置显微镜 电热鼓风干燥箱 电子天平 恒温水浴箱 离心机 压力蒸汽消毒器 液氮储存罐 细胞培养常用器材和培养基 细胞培养的实验用品 细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈 细胞培养板 ?6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔 细胞培养皿 ?35mm ?60mm? 100mm? 冻存管 1.2ml 2ml， 5ml 离心管 ?15ml ?50ml 细胞刮 一、常用器材 （一）玻璃器材 培养皿 滴流瓶 刻度吸管、离心管等 培养瓶 烧杯、量筒等 三角烧瓶 二、细胞培养常用器材清洗方法 （一）玻璃器材的清洗处理方法 1、浸泡：自来水浸泡（新的器皿用5%盐酸浸泡，以中和碱性物质）；（所有的器皿用过之后要及时浸泡） 2、刷洗：毛刷和洗涤剂或洗衣粉刷洗，自来水冲数次，洗净，干燥。 3、清洁液浸泡（泡酸缸）：在酸缸 (洗液:浓硫酸+重铬酸钾+水；棕红色)浸泡4h以上（通常过夜） 4、冲洗：自来水冲15-20次，洗净后再用蒸馏水漂洗2-3次，三蒸水漂洗1次，烤干，包装。 泡——刷——浸（酸）——洗 检测玻璃器皿是否清洗干净的方法：装满水，瓶口向下，看水流成片还是成股 （二）塑料器材（容易出现划痕）的清洗处理方法 1、用流水冲洗浸泡，或3%HCl或2%NaOH溶液并浸泡过夜（单用或交叉处理） 2、纱布或棉签沾清洁液刷洗； 3、水洗，晾干后浸泡如清洁液中15分钟以上 4、流水冲洗（15-20遍），蒸馏水润洗三次，晾干备用 （三）橡皮器材（各种瓶或试管的塞子、盖子） 1、使用后浸泡在清水中，刷洗. 2、5%NaOH煮15分钟，水洗， 3、4%盐酸煮，水洗8~10次， 4、自来水煮2分钟，蒸馏水煮20分钟， 5、50度烤干备用。 （四）金属器材（剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等） 擦去表面的油脂，洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，水洗，蒸馏水润洗， 95%酒精纱布擦干，包装灭菌 二、 灭菌 1、实验用玻璃器皿以铝箔纸或双层牛