电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳解读.docVIP

电泳技术 第一节 第二节  电泳技术概述 常见电泳技术 第二节  常见电泳技术  一 二 三  纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳  四 五  琼脂糖凝胶电泳 梯度凝胶电泳  六 七 八 九  等电聚焦电泳 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 印迹电泳 毛细管电泳 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简 称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性 、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。 1、聚丙烯酰胺凝胶的特点 可用于分离不同分子量的生物大分子 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 特 点  更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L 化学惰性好，电泳时不会产生“电渗” 电泳分离的重复性好 透明度好，便于照相和复印 机械强度好，有弹性，便于操作和保存 无紫外吸收 可用作固定化酶的惰性载体 2、凝胶聚合的原理及有关特性  （1）聚合反应　  凝胶单体 丙烯酰胺  加速剂 四甲基乙二胺 Acr TEMED 交联剂 N，N-甲叉双丙烯酰胺 Bis 催化剂 过硫酸铵(AP) 或 核黄素 （2）凝胶孔径的可调性及其有关性质  凝胶性能与总浓度及交联度的关系  T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）=  a?? b m b a?? b  ?100 ?100  其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)　 a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关  a/b＜10 a/b＞100 a/b=30  凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色 凝胶呈糊状，易于断裂 完全透明而又有弹性 C=6.5?0.3T 不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的 实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。 当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。  T为2%-5% T为5%-10% T为15%-20%  a/b=20左右 a/b=40左右 a/b=125-200左右 凝胶浓度与孔径的关系 T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。 孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时， 孔径最小。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30 ％之间。 低浓度的凝胶具有较大的孔径 高浓度凝胶具有较小的孔径 凝胶浓度与被分离物相对分子量的关系  分离胶浓度（%） 20～30 15～20 10～15 5～10 2～5  蛋白质相对分子量 10KD 10～40KD 40～100KD 100～500KD 500KD 3、影响凝胶聚合的因素  Acr及Bis 纯度 AP 核黄素 TEMED pH  分析纯；pH值为4.9-5.2； 4避光贮存 聚合在40-60min内完成 碱性条件下聚合较快，但碱性 过强时胶硬而脆 3、影响凝胶聚合的因素  温度 氧分子  一般25-35聚合 凝胶先抽真空脱气，再加引发剂 4、PAGE原理　 有无浓缩效应  连续系统 电荷效应 分子筛效应  不连续系统 电荷效应 分子筛效应 浓缩效应 不连续体系  电极 缓冲液  样品胶  浓缩胶  分离胶 样品胶T=3%,c=2% ，其中含有一定量的 样品及pH6.7的Tris- HCl缓冲液，其作用 是防止对流，促使样 品浓缩以免被电极缓 冲溶稀释。 直接在样品液中加入 等体积40%蔗糖。 浓缩胶 浓缩胶是样品胶的 延续，凝胶浓度及 pH值与样品胶完全 相同，其作用是使 样品进入分离胶前 ，被浓缩成窄的区 带，从而提高分离 效果。 分离胶 分离胶的T=7.0%- 7.5%,c=2.5%，缓冲 液为pH8.9的 Tris- HCl，大部分蛋白质 在此pH条件下带负 电荷。此胶主要起分 子筛作用。 （1）样品浓缩效应 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 凝胶孔径的不连续性 电位梯度的不连续性 电极缓冲液pH8.3 Gly- Gly- sample  缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 HCl在任何pH溶液中均易 解离出(Cl-)，在电场中迁移率  Cl- 浓缩胶pH6.7 快，走在最前面称为快离子。 甘氨酸pI=6.0，在pH8.3的 Gly- sample Cl- 分离胶pH8.