中梨1号ACC氧化酶基因反义表达载体构建及转化的研究.pdf

摘 要 中梨 1 号为优质早熟梨新品种，具有较好的市场前景。但该品种不耐贮藏，在贮 运过程中果实易衰老软化，失去其应有的商品特性，给梨生产和销售带来巨大损失。 乙烯是重要的植物成熟激素，调控梨果实的成熟衰老过程，因此降低梨果实内源乙烯 的合成，是延长果实贮藏、保鲜期的根本途径之一。利用反义RNA 技术对乙烯合成 的重要限速酶 ACC 氧化酶的基因表达进行抑制将会有效降低乙烯的内源合成。本研 究以中梨 1 号为试材，建立了梨离体叶片不定芽再生体系和遗传转化体系，并通过农 杆菌介导基因转化法成功将外源反义 ACC 氧化酶基因导入中梨 1 号，获得了转基因 植株，填补了梨反义 ACO 基因遗传转化研究的空白，也为运用基因工程技术调控梨 果实成熟衰老的研究提供了重要参考。本研究取得的主要结果如下： 1. 建立了高效、稳定的中梨 1 号叶片不定芽再生体系 在苗龄为 25～30d 的继代试管苗上剪取顶部幼嫩平展叶片，垂直中脉刻伤后，远 轴面向下接种于NN69+TDZ 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖20g/L 的诱导培养 基上，暗培养 21d 后转入光下正常培养，不定芽诱导率达 85%，单叶出芽数2.72 个； 培养基中添加 1mg/L 的AgNO3 可进一步提高不定芽再生率。 2. 构建了中梨 1 号 ACC 氧化酶基因反义表达载体 根据已发表梨 ACC 氧化酶基因保守序列设计一对引物，以中梨 1 号成熟果实 cDNA 为模板扩增得到 520bp 的中梨 1 号 ACC 氧化酶基因 cDNA 片段，将此片段反 向连接在pBI121 质粒上构建 ACC 氧化酶基因反义表达载体，并进一步将表达载体转 化农杆菌 LBA4404 。经质粒提取和 PCR 检测，该反义表达载体构建成功并已转化 LBA4404 ，为下一步遗传转化研究提供了转化工具。 3. 优化了梨遗传转化体系 选取中梨 1 号试管苗顶部平展幼嫩叶片，垂直中脉刻伤后远轴面向下接种在 NN69+TDZ 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L 再生培养基预培养 2d ，浸入 OD600 值 0.5～0.6 的农 杆菌菌液中侵染 10min，远轴面向上共培养 2d 后正向接入添加有 200mg/L 头孢噻肟 钠的再生培养基进行杀菌和诱导培养，1 周后转入添加 5mg/L 卡那霉素的再生芽选择 培养基。待抗性芽长至 1cm 左右时，将芽转入添加 20mg/L 卡那霉素的抗性苗筛选培 养基进行筛选。 4. 获得了 27 株中梨 1 号卡那霉素抗性植株，经 PCR 检测及 Southern 分析，其 中3 株为整合了目的基因片段的转基因植株。 关键词：梨；不定芽再生；ACC 氧化酶；反义表达载体；农杆菌介导；遗传转化 Construction of plant antisense expression vector for pear ACC oxidase gene and its transformation to ‘Zhongli 1’ pear (Pyrus spp.) Author: Liu Jie Major: Pomology Supervisor: Prof. Zhang Yuxing Abstract ‘Zhongli 1’ pear is a new early-ripening and high-quality cultivar, with a bright marketing prospect. The storage life of ‘Zhongli 1’ fruit is very short, which makes it easy to deteriorate and lose market value during storage period. The