RNA干扰与应用.pptVIP

RNA干扰 简介 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类: TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录; PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 何为RNA干扰技术 RNA 干扰( RNA Interference ,RNAi) 是通过体外人工合成的或体内的双链RNA( Dubble- stranded RNA,dsRNA) 在细胞内特异性的降解其同源mRNA, 使相应的基因沉默, 达到阻止基因表达的目的。 Glossary (术语) RNAi----- RNA interference(RNA干扰) siRNAs-----Small interfering RNAs (小干扰性RNA) dsRNA------double strand RNA(双链RNA) RISC------RNA-induced silencing complex(RNA诱导沉默复合物) RdRP------- RNA-directed RNA polymerase (RNA指导RNA聚合酶) Dicer------ RNaseIII—related enzymes (RNaseIII家族成员) PTGS------Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默 RNAi发生过程 RNAi发生的基本过程可分为起始阶段和效应阶段。 在起始阶段,一种称为Dicer的酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等各种方式引入的dsRNA，短的dsRNA继而形成有效复合物：RISC、RITS或miRNA。RNaseⅢ的2个催化中心由2个单体酶组成，其核体以反向平行的排列方式与dsRNA结合形成4个活性中心。中间2个未被活化，使得作用中心有一定的距离，因此Dicer能将dsRNA比较均匀地切成21—23nt大小的siRNA(short／small interference RNA)。Dicer的结构变化会引起siRNA长度的改变，这使得siRNA具有种族差异。产生的siRNA有3大特点；①长度为21—23nt；②末端有2nt未配对碱基；②5’末端磷酸化。 在效应阶段，siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，然后利用其内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，随后，RISC中的核酸内切酶在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割靶RNA，最后，切割后的靶RNA在核酸外切酶的作用下被降解掉，导致目的基因的沉默。 目前研究比较清楚见使用较多的一种基因沉默小分子是siRNA，它分别在两种的水平上引导基因沉默，体现RNAi的作用。 (1)转录水平 (2)转录后水平 转录水平 RNA介导的DNA甲基化(RNA—directed DNA methylation，RdDM)被最早发现于类病毒感染的番茄中。dsRNA被降解成21—23nt的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核可诱发同源序列的DNA甲基化。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA—DNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。 转录后水平 首先特异性的Dicer酶依赖ATP切割dsRNA，将其分解成具有2个核昔酸的3’末端的小片段的双链siRNA。其次RISC识别并降解mRNA。RISC是一种蛋白—RNA效应器核酸酶复合物。双链siRNA为RISC的重要组成部分，它依赖ATP解旋并导致RISC活化，然后通过碱基互补配对识别底物mRNA与之结合，并自siRNA的3’端将mRNA切割成小于12nt的片段使其降解。 RNA干扰所涉及的技术 一般来说，任何克隆的基因都可能成为寡RNA的靶，不管该RNA是人工设汁的，还是RNA表达的病毒载体，只要其与靶基因转录的mRNA具有序列互补性即可。下面将RNAi主要涉及到的技术作一般的介绍。 干扰RNA(siRNA)及合成 RNAi质粒和病毒裁体的构建 转染方法 干扰RNA(siRNA)及合成 20~23bp的双链siRNA是可以进行大量合成的，而且也很容易进行细胞的转染。 在一过程中，首先需要获得目的基因的cDNA序列，然后以cDNA为模板合成siBNA。 一般人们选择的区域是以靶基因转录物的AUG