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干扰素epsion及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体治疗人卵巢癌的体外研究
中文摘要
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,发病率高,早期临床诊断困难,70%的患者发现时已
属晚期。尽管卵巢肿瘤细胞减灭术和化疗水平不断改进,但60%以上的患者最终将复发,
晚期卵巢癌的五年存活率仍徘徊在30%左右,目前为止仍然是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,
因此寻找一种新的治疗方法十分必要。基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌的基因治
疗奠定了基础,成为继放疗、化疗、手术治疗之后的第四种治疗模式。本实验初步探讨了
方法提供了实验依据。
第一部分
干扰素epsilon基因提取及其真核表达载体构建
许多实验表明,在体内外干扰素都能够控制肿瘤生长和抑制肿瘤复发转移。人干扰素
活性,是一种具有广泛应用前景的新型干扰素。
PcDNA3.1-IFN-£。
X106个,用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,将其
方法:收集人宫颈癌HeLa细胞约3
应产物通过琼月旨糖凝胶电泳鉴定后,经DNA凝胶回收试剂盒纯化后酶切,回收酶切产物,
插入经相同酶切的质粒PcDNA3.1中,连接酶连接过夜,构建成真核表达质粒
PcDNA3.1.IFN-E:,通过酶切后电泳鉴定,经测序证实其插入序列的正确性。
泳,可见在645bp处有一条清楚条带。2、表达质粒的构建:提取重组质粒DNA,经酶切,
报道的IFN嵋序列一致。
结论:本实验提取了基因IFN-e并成功构建了其真核表达载体,经酶切和测序证实其正
确,为进一步研究IFN.e在卵巢癌细胞中的作用奠定了基础。
关键词:IFN-8’RT-PCR,基因克隆
. 第二部分
TRAIL基因提取及其真核表达载体构建
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TR
因子超家族中重要的新成员,它可以选择性杀伤肿瘤细胞及转化细胞,而对正常细胞几乎
没有明显的杀伤作用,这一特殊的选择性使其在肿瘤治疗中具有很广的应用前景。
载体pEGFP-N3·TRAIL。
的基因,其反应产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后,经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后酶
切,回收酶切产物,插入经相同酶切的质粒pEGFP-N3中,连接酶连接过夜,构建成真核
表达载体pEGFP-N3.TRAIL,通过酶切后电泳鉴定,经测序证实其插入序列的正确性。
I和
见在865bp处有一条清楚的条带。2、表达质粒的构建:提取重组质粒DNA,经Xho
EcoR
与Genebank中报道的豫4尼序列一致。
结论:本实验成功提取了基因TRA/L并构建了其真核表达载体,经酶切和测序证实正
确,为进一步研究TRAⅡ,对卵巢癌细胞的作用奠定了基础。
关键词:RT-PCR,TRAIL,基因克隆
第三部分
转染重组质粒对卵巢癌细胞作用的体外研究
细胞的体外作用及其机制。
方法:人卵巢癌细胞株SKOv3体外培养达对数生长期时,采用脂质体转染真核表达
同转染组对人卵巢癌细胞的生长抑制作用,流式细胞术观察两者作用于卵巢癌细胞后的细
胞凋亡情况,RT-PCR检测不同转染组Survivin的表达水平。
Ⅱ
PcDNA3.1.1FN.£转染组细胞凋亡率分别为21.4%、19.1%,两者联合作用细胞凋亡率为
两重组质粒单独转染组均明显降低(Po.01)。
结论:转染TRA/L和IFN.£真核表达质粒均可抑制卵巢癌细胞的生长,诱导其凋亡;
一定时闯内随着时闻延长,细胞生长抑制率呈上升趋势,具有时间效应关系;两者联合明
显增加卵巢癌细胞的生长抑制率和凋亡率,具有协同作用;TRAIL和IFN-£:作用于卵巢癌
可能与Survivin表达降低有关。
关键词:卵巢癌,刺L,IFN-e,转染,细胞凋亡,基因治疗
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山西医科大学硕士学位论文
THERESEARCHONTHECOM略INArIONO
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