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实验一油镜的使用和细菌的简单染色 一、目的要求 1.学习并掌握使用油镜的原理和方法。 2.通过简单染色，初步认识细菌的形态特征。 3.掌握染色的基本技术和无菌操作技术。 二、实验原理 1、油镜的使用原理 普通显微镜通常配置几种物镜，其中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有两方面的原因： （1）增加照明亮度：油镜的放大倍数为100×，其焦距很短，但所需要的光照强度却最大，从玻片透过来的光线，有些会因折射和反射不能进入镜头，致使物象不清。为了不使光线有所损失，在使用油镜时，需在镜头与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油（香柏油）。 （2）增加显微镜的分辨率：由于香柏油的折射率比空气和水的折射率要高，因此以香柏油为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径要高于低倍镜、高倍镜等干镜。 2、简单染色原理 利用单一种染料对菌体进行染色的方法称为简单染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 3、无菌操作技术原理 高温对微生物具有致死的作用，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌目的，但一定要注意冷却后再进行转接，以免烫死微生物。如果转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管；如果只取少量而且无需定量也可用接种环，视实验目的而定。 三、器材 1、菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌(E.coli)和口腔细菌。 2、染色剂：结晶紫染液或碱性复红。 3、仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油、二甲苯）、擦镜纸、生理盐水。 四、步骤： 1、涂片：取三块载玻片，分别滴一滴生理盐水于载玻片中央，用接种环以无菌操作技术分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌少许菌苔于水滴中（口腔中细菌用牙签从口腔中刮取），均匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹，取菌适量，涂片要均匀，不宜过厚。注意无菌操作。 2、干燥：自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过火焰2—3次。 热固定时温度不宜过高，否则会改变或破坏细胞形态。 4、染色：滴加染液于玻片上，以刚好覆盖涂面为宜，染色1min。 5、水洗：用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 6、干燥：自然干燥。 7、镜检：涂片干后镜检。按照先低倍镜后高倍镜再油镜的顺序进行。油镜的滴加方法为：在高倍镜下找到观察样品区域后，用用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心下降，使油镜浸在镜油中几乎与标本相接。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器使镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像，并使用细调节器使其清晰准焦为止。 油镜使用完毕后一定要将油镜镜头擦试干净。 五、作业： 1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片与物镜镜头间滴加香柏油的作用是什么？ 2、绘出在油镜下观察到的细菌形态图。 3、思考题： （1）在进行涂片时应注意那些环节？ （2）进行细菌制片时为什么要进行热固定？在加热固定时应注意什么？ （3）为什么要在制片完全干燥后才能进行油镜观察？ （4）进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？ （5）进行简单染色的目的及原理是什么？进行微生物制片时是否都需要染色？为什么？ （6）根据你的实验结果，对细菌进行简单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？ （7）你是否观察到金黄色葡萄球菌聚集成葡萄串状？试解释其形成原因。 实验二细菌革兰氏染色法、芽胞染色和荚膜染色 一、目的要求 1、掌握革兰氏染色法。 2、掌握芽胞染色法并观察芽胞的形态特征。 3、掌握荚膜染色法并观察荚膜的形态特征。 4、巩固显微操作技术及无菌操作技术。 二、基本原理 1、革兰氏染色原理 革兰氏染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，其原因是这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢氏碘液进行媒染处理，由于形成碘—结晶紫复合物增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不