克隆表达真核表达系统.pptVIP

克隆载体与表达载体 克隆载体（cloning vector)：用于携带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。 主要元件：复制起始点（ ori)、复制非必需区、多克隆位点、筛选标记及辅助序列 原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体 主要元件：强启动子、 SD顺序、 筛选标志 其它调控基因 克隆载体中常用的辅助序列 lacZ’、lacI基因：蓝白斑筛选 SP6、T7RNA聚合酶启动子：体外转录 F1复制起始点：产生单链DNA 酵母表达载体 含酵母启动子 穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。 种类：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体 酵母人工染色体（yeat artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA 真核生物染色体中的关键部位（分裂、复制必需区） 着丝粒(centromere,CEN):分裂 端粒(telomere,TEL)：保护染色体、维持染色体复制 自主复制序列(autonomously replication sequence，ARS)：复制起始位点 啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体------整合型 YAC:利用酵母的TEL、ARS及CEN构建的人工染色体 结构：左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN、 右臂：TEL、选择标记 特点：容量大（50-1000kb），减少克隆数 稳定性差，不易分析 （二）受体细胞 1、啤酒酵母：较早使用，了解清楚 表达量较低 过量糖基化 转化子不稳定 2、毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞 高表达（12mg/L） 高稳定-----载体为整合型 高分泌（10mg/L） （三）转化 1、原生质体法：去除厚壁 2、电穿孔法：效率较高 （四）外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列 （五）缺点 不能实现全部的翻译后修饰功能 五、外源基因在哺乳动物细胞中的表达 ----------哺乳动物细胞表达系统 进行完全的翻译后修饰 可表达产生有功能的膜蛋白 用途：表达大量的外源蛋白 基因治疗 （一）几种常用的哺乳动物病毒载体标志基因 1、胸苷激酶(tk)基因 2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因 3、新霉素抗性基因(neo) 1、胸苷激酶(tk)基因 tk+细胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→dTTP 二氢叶酸 二氢叶酸还原酶 四氢叶酸 dTTP dCTP dATP 氨基喋呤(A) tk 阻断 补加次黄嘌呤（H） 死亡 存活 胸苷(T)→胸苷-磷酸→dTTP tk 以tk－为受体，载体中加入tk基因， HAT选择培养基中tk+细胞成活，tk-细胞不能成活 则阳性重组子可在HAT中成活。 2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因 dhfr-细胞无法在普通培养基中成活，而带有dhfr的阳性重组子则可以生存。 以dhfr-细胞为受体 二氢叶酸 二氢叶酸还原酶 四氢叶酸 dTTP dCTP dATP 3、新霉素抗性基因(neo): 新霉素的类似物G418同时对原核、真核均有毒 neo编码的酶可使G418灭活 此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便。 （二）哺乳动物表达载体 1、主要元件 启动子：动物来源的：SV40、CMV、RSV、ADV、LTR 细胞来源的：HSP、MCK 增强子: 来源于SV40、RSV、CMV、LTR（在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力） 筛选标记 原核及真核复制起始点 转录终止信号和多聚酰苷酸化信号 2、哺乳动物细胞表达载体 病毒颗粒型载体-----外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制 (多需辅助病毒或包装细胞的存在)。如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 质粒型(复制子型)载体----由真核复制信号、启动子,转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。如： pSV系列、pCDNA3等 SV40(猴肾病毒)载体 ? 基因组结构清楚,含有整套基因表达调控序列 早期区：溶源生长所必需 晚期区：产生病毒衣壳蛋白，包装病毒颗粒所必需----外源基因取代 复制起始位点：早、晚期之间 ? 载体构建：早期取代 晚期取代 ? 天然SV40载体宿主范围窄，容量小(2.5kb)易形成野生型V，故较少应用，而是利用其调控元