猪囊尾蚴特异性原基因的cDNA的分子克隆.pdfVIP

中文摘要 猪羹尾蚴特异性抗愿的eDNA分子克蠹 摘 要 目的：囊虫病是由囊尾蚴引起的人兽共患病，是一种 世界上分布较广的寄生虫病。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等 重要器官寄生，其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的 临床症状最为严重，极大危害了人类健康。然而目前临床 上对该病的诊断仍以CT或磁共振(MR)作为最主要的客 观指标。但鉴于CT或MR高昂费用，因此单凭CT或MR 作为标准进行疗效评价及大规模的流行病学普查是很不现 实的。研制简便、快速、准确的诊断方法及诊断试剂已成 为当前国内外医学专家攻克该病的工作的重点。随着基因 工程技术手段不断完善，分离出特异性高、敏感性好的蛋 白抗原已成为可能。本研究采用基因重组技术，以开发囊 虫病特异性诊断用融合抗原和预防用疫苗为目的，从已构 建的猪囊尾蚴eDNA文库中拟筛选出囊尾蚴特异性抗原基 因，从而为进一步研究其蛋白质功能、结构奠定基础。 方法：1、病人血清的预处理：将经CT或磁共振(MR) 确渗的脑囊虫病人血清按l：10比例稀释于TBS缓冲液中， 稀释后血清与液氮反复冻融后的XLl．Blue-MRF’菌裂解液 min，取上清收 充分混合，室温放置4小时，5009离心10 获吸附后抗血清。2、eDNA文库免疫学筛选：用此血清作 为一抗，以辣根过氧化酶标记的羊抗人抗体作为二抗，筛 选已构建的猪囊尾蚴eDNA文库，获得含阳性eDNA的噬 菌体，经液体培养后提取噬菌体DNA。3、阳性eDNA片 ～一 ±查苎墨 一 一 ——_—————J____________—_—_————●———--_____—_—P—-————————————一一 段的PCR扩增：以筛选出的噬菌体DNA为模板t利用 cDNA插入片段两端的通用引物T3和T7进行PCR扩增， rain，56。C退 94。C变性l mira 扩增条件为：94。C预变性5 min。 火1min，72。C延伸lrain，30个循环结束72。C延伸10 4、eDNA片段的亚克隆：PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝 胶回收纯化后，经EcoRI及KpnI末端修饰与含相应粘性 末端的PUCl8质粒载体进行体外定向重组，连接产物转化 JM1 感受态E．coli09，在含氨苄青霉素、IPTG以及X—gal 的LB培养基培养，根据13．半乳糖甘酶的Q互补原则筛选 雨组予挑选白色菌落，按碱裂解法提取质粒后进行双酶切， 鉴定是否含有插入片段，5、序列测定及同源性比较：用 Sanger双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列，用 GENETYX软件分析推导核苷酸序列编码的氨基酸序列， 酸序列同源性检索，寻找同源片段。6、进行Northem杂 交分析确定该阳性片段mRNA大小：利用异硫氰酸胍一步 法提取猪囊尾蚴总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光 度法测定其完整性、纯度以及含量；走RNA变性电泳(甲 X 醛变性凝胶电泳)分离RNA，以20SSC作为转移液经毛 细管虹吸作用将变性凝胶中RNA转移至尼龙膜上，80℃干 烤2小时固定RNA，以筛选出的阳性cDNA片段为模板按 照随机引物标记法对其进行同位素标记制备杂交用探针， 与尼龙膜上已经过预杂交的RNA进行杂交反应，洗膜后进 行放射自显影，确定杂交信号大小。 结果：从eDNA文库中筛选出长度为553bp的cDNA 片段(命名为cⅥ)，Northem杂交结果也显示在0．6kb处 中文摘要 有一杂交带。该基因片段含有一个开放读码框，位于 2-484bp处，编码160个氨基酸，分子量为18．34kDa。序列 5，端未发现起始密码子，末端有TAA组成的终止密码子位