第六章目的基因的分离2014资料.ppt

基因工程的基本步骤 第六章 目的基因的分离 基因工程的上游工程是目的基因的制取和无性繁殖。 具体地说是从生物体的组织、 器官或细胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因与载体连接，导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程称为基因克隆（gene cloning）。 克隆的概念: 个体水平上: 表示由具有相同基因型的同一物种的两个体或数个个体组成的群体,如双胞胎. 细胞水平上:由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体. 分子水平上:凡带有一段DNA插入序列的,独特的寄主/载体单元亦叫克隆.比如重组质粒载体 克隆基因的方法 PCR或人工合成法 从基因组文库或cDNA文库中分离基因 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法  基因文库：指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合 按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA library）。 一、cDNA文库的构建与筛选 (一) 概念： 将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成 cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后转化给大肠杆菌寄主细胞，这个细胞群体内包含了所有基因编码序列的cDNA分子，被称为cDNA文库。 cDNA文库特点 只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定的状态是由特定基因的表达所决定，因此各自的mRNA的种类不同，由此产生出独特的cDNA文库。任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。  cDNA文库的优越性 以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒 筛选比较简单易行. 假阳性概率低 cDNA克隆可进行原核表达 构建cDNA文库应满足的条件 文库的代表性:文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性. N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T) P:文库中筛选出某一确定克隆的置信度,一般情况下选择0.99. N:文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数; n:细胞中最低丰度的mRNA的拷贝数; T: 细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数 重组cDNA片段的序列完整性 (二)、构建cDNA文库的方法 （1）分离细胞总RNA，从中分离出mRNA。 （2）以mRNA为模板，逆转录合成第一条cDNA链。 （3）将mRNA-DNA杂交分子转变为双链DNA分子。 （4）将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞内增殖。 通常用λgt10/λgt11及与其相当的载体来组建非表达的cDNA文库，而一般不用转化效率较低的质粒作载体。 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第一链的合成 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法 克隆入载体中: 平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收 (三) 目的cDNA克隆的筛选 核酸杂交 免疫学杂交检测:通过重组克隆所表达的基因产物筛选目的克隆 如果双链cDNA重组到表达载体上，则cDNA就能随着表达载体而表达出融合蛋白质，这样的文库称为cDNA表达文库 PCR cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因 二、基因组文库的构建与基因分离 基因库（gene pool）:特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因组文库（gene library or gene bank） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增.理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因组文库。 2. 构建基因文库的载体选用 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少 目前常用的载体 ?载体系列： 容量为 23 kb cosmid载体： 容量为 45kb YAC： 容量为 450-1 Mb BAC: 容量为 300 kb 3 构建基因组文库应满足的条件 （1）文库的完整性: 在