应用单细胞逆转pcr和抑制差减杂交技术研究辐射致癌相关基因.pdf

应用单细胞逆转录PCR和抑制差减杂交 技术研究辐射致癌相关基因 中文摘要 物理、化学、生物是环境致癌的三大因素，而电离辐射是最常见 的物理致癌因素之一，随着核能在国民经济和军事领域中的应用越来 越广泛，电离辐射对人类的潜在危害也不断增加，辐射致癌是最重要 的电离辐射远后效应，对辐射致癌分子机理进行研究，是肿瘤学、放 射生物学、预防医学与辐射防护学探讨的重点。其研究成果涉及国民 健康、能源利用、环境与战争，因而具有重要的社会、军事、经济与 政治意义。 大量的研究表明辐射可导致基因突变或染色体畸变，进而启动或 推进细胞恶性转化，细胞恶性转化主要是基因突变、基因表达改变积 累的结果，因此阐明辐射致细胞恶性转化的机理需从基目水平进行研 究。已有的研究局限于为数不多的已知重要癌基因、抑癌基因，而肿 瘤的发生是一个非常复杂的过程，涉及到很多与肿瘤相关基因的改变 和功能异常，因此阐明辐射致癌机理需要从整体的角度，全面识别正 常细胞与相应恶性转化细胞之间的差异表达基因，寻找未知的参与细 胞恶性转化过程的基因。 抑制差减杂交(SSH)就是以上研究的最有力工具之一，其依据 的技术主要是抑制PCR和差减杂交。该方法得到的cDNA群体不仅 第l页 中文摘要 富集了差异表达的基因，而且目的基因间丰度的差异经过均衡化作用 已基本消除，特别适用于低丰度克隆的分离。同时该方法灵敏度高、 重复性好，操作简便，初始mRNA仅需l一2ug，前后3～4天时间， 即可得到富集的差减eDNA群体。该技术已经成为分子生物学领域研 究两个细胞群体间差异表达基因的有力工具，为研究肿瘤发生发展中 的基因开关及表达程序提供了极大的便利，推动了细胞遗传、生长、 分化及癌变等许多领域的研究。 但是高等动物作为高度分化的系统，其差异基因表达分析往往需 要大量纯化的同质细胞，即便使用SSH技术也要求初始样本的mRNA 达到l～2ug，即所需细胞数达到106数量级。大量同质细胞获取的困 难无形中就增加了实验研究的难度，也阻碍了研究领域的扩展。常规 的全组织获取样本方法，由于细胞异质性的影响，使得实验结果只能 说明一个细胞群中基因表达的大致情况，而那些导致了细胞分型甚至 细胞间唯一差别的表达特性却不能得知。而利用单细胞逆转录PCR 方法代表性扩增全细胞mRNA，建立一微量细胞的基因表达分析系 统，就能够解决分化系统的异质性和细胞全基因组表达模式分析所需 大量纯化细胞获取困难之间的矛盾。 全细胞eDNA，从不同细胞中扩增的eDNA可用于构建差减文库或 eDNA文库继而进行差异杂交，筛选不同细胞或组织间差异表达的基 因。以此技术为基础，就可以建立微量细胞的基因表述分析系统，对 数量稀少至单个细胞的样本进行基因表达的分析，这将极大的缓解大 第2页 硕t。论文 中文摘要 量同质细胞获取的困难，特别是对于来源极其有限的珍贵样本来说具 有更大的意义。随着近年来基因组计划的顺利实施，应用该方法还可 产生少到1个细胞的细胞类型／组织类型特异的或发育阶段特异的全 细胞cDNA，并以此为探针来筛选微排列于DNA芯片上的cDNA丈 库，从而能够鉴定在这些细胞中所有基因的表达状态。同时，这种在 单细胞水平上进行基因表达分析的技术，也将有助于揭示同质细胞中 基因表达的个体独特性的现象，证实细胞对于基因表达调控的有限 性。 本研究分三个部分对以上问题进行了深入研究：首先建立稳定可 靠的单细胞RT-PCR实验体系，包括序列非依赖性扩增全细胞mRNA 法，并对各个环节的条件进行了优化；其次选定一新的肿瘤抑制基因 v射线照射BEAS．2B细胞后人FHIT基因的早期动态变化进行了研 究；最后以60C01，射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象， 采用抑制差减杂交技术对辐射致小鼠肿瘤发生过程中的差异表达基 因进行了全面的分析。结果发现：l、经过扩增代表性检测发现单个 细胞中的全部mRNA都得到了有效扩增，电泳显示长度在o．2～2kb 的片段居多，核酸定量发现扩增产物可达ug水平，足够常规分子生物 脂糖凝胶电泳上呈现一特异条带，表明单细胞RT-PCR对目的基因的