土拨鼠ctla 的原核表达和多克隆抗体的制备.pdf

华 华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 土拨鼠 CTLA4 的原核表达和多克隆抗体的制备 硕士研究生 陈尊义 导 师 陆蒙吉教授 华中科技大学同济医学院病原生物系微生物教研室 中文摘要 研究背景： 土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus ，WHV ）属于嗜肝DNA病毒，与 人乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus ，HBV ）关系十分密切，在基因组结构、病毒 复制和病毒感染过程等方面都十分的相类似[1,2,3] ，是目前已知的用于研究乙肝病 毒的致病机制和筛选新的抗病毒药物，并且在研制新的疫苗中发挥重要作用的最 理想小动物模型。目前各国学者对乙型肝炎病毒难以清除，如果机体缺乏有效的 T细胞免疫会最终导致慢性化这一点是持一致和肯定意见的。注重于探讨抗病毒 反应引起T细胞活化的相关因素在以往的研究中多有涉及，但是却忽略了一个目 前已经逐渐认识到了的重要问题：负调节机制在抑制T细胞活化方面同样发挥重 要作用。近年来的许多研究表明乙肝感染程度除了与免疫反应的强度有关之外， 它同时又是一个被许多细胞因子相互调节的过程，这其中就包括细胞表面的受体 [4] CTLA4 。 在本研究中，通过分子克隆的手段成功将 CTLA4 构建到原核表达载体中并在 大肠杆菌 BL21 （DE3 ）进行诱导表达，并最终制备了多克隆抗体。这一实验结 果为进一步完善土拨鼠模型相关指标，检测和研究 CTLA4 在正常、急性、慢性 WHV 中的表达，评估CTLA4 在肝炎慢性化中的作用奠定一定的基础。 1 华 华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 目 的 1. 构建土拨鼠 CTLA4 的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。 2. 制备了多克隆抗体，同时检测土拨鼠 CTLA4 的特异性和灵敏性。 方 法 1. 应用基因工程技术将土拨鼠的CTLA4 的基因片段装入原核表达载体，转化表 达菌后诱导目的蛋白的表达，应用电洗脱方法纯化目的蛋白，并用SDS 和Western blot对表达产物（目的蛋白）进行相应鉴定。 2. 用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，并纯化多克隆抗体。 结 果 1. 通过 PCR 鉴定、酶切鉴定,并在核酸测序后与 CTLA4 的原始序列比对，结 果表明成功构建土拨鼠 CTLA4 的原核表达载体。 2. 用目的蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验 （ELISA ），Western blot 等方法对多克隆抗体的灵敏度和特异性进行检测。 关 键 词 土拨鼠 乙型肝炎 原核表达 多克隆抗体 2 华 华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学