第六章蛋白质定量和定性资料.ppt

第一节 蛋白质含量测定 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法 实验试剂与仪器 实验试剂 浓硫酸 硫酸钾（提高沸点）沸点由330℃提高到400℃加速了消化过程。 硫酸铜 （催化剂） NaOH溶液(30%) 硼酸溶液(2%) 盐酸标准溶液（0.01 mol/L ） 指示剂 :溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。 二 蒸馏器清洗 图中所示的蒸馏器使用方法如下: 开放自来水龙头,使水从E进入G,从K流出,(水不宜开得过大以免水从G溢出).开放P3使水进入A,从漏斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指将G管口掀紧.同时开放P1则B中水从Y型管中冲出.随后A中水经K流出.一般情况下,如此重复洗涤两次即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml后蒸馏一次方可使用. A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收 (四)、注意事项 e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色. f.硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失. g.蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面,再蒸2min后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。 二、Folin-酚试剂法 一、实验原理 Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝混合物)，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。 Folin-酚法优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。 可测定范围20～250ug蛋白质 。反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。 此法也适用于测定Tyr,Trp含量。 其不足之处是此反应受多种因素干扰。 二.实验用品 1.材料：待测样品,使用前稀释至合适的倍数 2.试剂 ⑴标准牛血清(或酪蛋白)溶液:　称取125毫克蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液润湿，溶解，加蒸馏水到250毫升，则配成500微克/毫升的标准蛋白溶液。 ⑵Folin-酚试剂甲 : ⑶Folin-酚试剂乙: 3.仪器设备 三.方法和步骤 1.标准曲线的制作:将6支干净试管编号，按下表进行操作 2.样品中蛋白的测定 取2支试管，分别加入0.2毫升样品(待测)稀释液，再加入0.8毫升蒸馏水使样品体积达到1毫升。 将样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的标准蛋白溶液的浓度。然后乘以稀释倍数，得出未稀释样品含蛋白质的克数。 四.实验结果 计算： 总蛋白含量=(蛋白含量/0.2ml)×总体积 三、紫外光吸收法 四、考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。 该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定