现代酶工程2酶的发酵生产教案.ppt

* * * 小结： 影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。 （1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。 （2） mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。 选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。 改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件： （1）同步合成型： 适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。 （2）中期合成型： 要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。 （3）滞后合成型 在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。 选择与改造 动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。 植物、动物、微生物细胞的特性比较 细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞 细胞大小/um 200～300 1～10 10～100 倍增时间/h ﹥12 0.3-6 ﹥15 营养要求 简单 简单 复杂 光照要求 大多数要求 不要求 不要求 对剪切力 敏感 大多数不敏感 非常敏感 主要产物 色素、药物、香精、酶等 醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等 疫苗、激素、单克隆抗体、酶等 植物细胞培养产酶 从外植体中→选育植物细胞→高产稳定细胞→培养→各种产物 1.植物细胞培养的特点 提高产率和产品质量 缩短周期 易于管理 2.培养基特点 ①需要大量无机盐 ②需多种维生素和激素 ③氮源一般为无机氮 ④一般以蔗糖为碳源 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。 3.培养工艺：——悬浮细胞培养 ⑴工艺流程 外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化产物 ①外植体选择和处理 选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。 外植体： 从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。 水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织 外植体 愈伤组织 ②植物细胞获取 直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法 ③细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养 ④分离纯化：生化技术 机械法 酶法 ⑵ 培养条件的影响与控制 ①温度：室温25℃ ②pH：微酸性范围。即pH 5.0-6.0 ③通气与搅拌 ④光照的控制：强度和时间有一定要求 ⑤前体的添加（饲喂） ⑥刺激剂的应用 4.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。 (2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。 (3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。 动物细胞培养产酶动物细胞培养的特点 动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合） 细胞生长速度慢 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵 细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养 原代细胞一般繁殖50代 2.培养方式 (1)悬浮培养 (