Tan第六章外源基因的表达创新.ppt

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第六章 外源基因的表达 第一节 大肠杆菌表达系统 第二节 E. coli 重组蛋白的限制因素 第三节 真核生物表达系统 引言 生物技术的应用可以追溯到4000年前，新石器时代的晚期，利用发酵过程生产蜂蜜酒。20世纪，随着一系列的微生物在工业上的应用，生物技术得到了广泛的发展。1927年，Alexander Fleming发现Penicillium能够合成青霉素。随后，真菌和细菌被广泛应用于大规模的生产抗生素。许多重要的医药，并不是来自于微生物，而是高等生物产生的。基因工程的应用，带来了生物技术的革命。基因工程意味着重要的植物或动物蛋白基因可以从宿主中分离出来，插入载体，引进细菌获得大量蛋白。 外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。 有基因表达载体和受体细胞两部分组成。 原核基因表达系统和真核基因表达系统。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞的特点： 单细胞异养，生长快，代谢易控制。 基因组结构简单，基因操作和分析容易。 含有质粒或噬菌体，易于构建表达载体。 生理代谢途径及基因表达控制机制比较清楚。 无真核生物的蛋白质加工系统。 有内源蛋白酶 原核细胞： 起始密码子首选AUG; SD序列；SD序列与起始密码子的距离（3～9bp）；翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。 真核细胞： 起始序列的共同序列-CCA(G)CCAUGG- 密码子的使用频率 终止密码子：UAA mRNA的延伸与稳定性 防止非特异性终止： 避免衰减子；加入抗终止的序列元件。 转录终止序列： 保证转录正常终止，防止产生不必要的转录终止产物，使mRNA的长度限制在一定范围内，增加外源基因表达的稳定性。 Poly(A)掺入信号序列 表达蛋白在细胞中的稳定性： 防止表达产物被内源蛋白水解酶水解 途径： a. 构建融合蛋白表达体系 b. 构建分泌蛋白表达体系 c. 构建包涵体表达体系 d. 选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统 目的基因的沉默 位置效应的基因沉默 转录水平的基因沉默 转录后水平的基因沉默 第一节 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌基因表达载体的重要组成元件： 启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7 核糖体结合位点 插入位点 终止子 复制起始区 选择标记 外源基因在大肠杆菌中的表达形式： 包涵体、融合蛋白和分泌蛋白 寡聚型外源蛋白： a. 多表达单元的串联重组 b. 多顺反子重组 c. 多密码序列重组 整合型外源蛋白：将外源基因整合到宿主染色体非必需编码区，在合适的条件下高效表达。 融合蛋白、分泌蛋白和包涵体 融合蛋白(fusion protein)：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。 分泌型蛋白(secreted protein)：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。 包涵体(inclusion body)：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。 一、基因表达信号 如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最重要的信号：　　1） promoter: 是转录起始信号，在E. coli中，启动子必须能被RNA聚合酶的sigma亚基所识别。　　2） Teminator：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。 　　3） 核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。　　高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与E. coli的并不相同。比较E. coli和人类的启动子，有一些是相同的，但是E. coli的RNA聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号。 基因表达的信号 解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E. coli表达信号