5分子生物学研究方法1解析.ppt

分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 （2）ColE1质粒载体 ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。 ??? DNA操作技术 1、核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 基本原理 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 碱性条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50 kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘红色荧光，易于鉴定。 2、 细菌转化 转化：异源DNA分子导入受体细胞的过程 受体菌与质粒的选择 受体菌： E.Coli DH5α：无Ap抗性 外源质粒 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 选择: 如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α 、JM109 、 TG1 ； 用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)； 电击法：电脉冲可以再细胞膜上造成小凹陷，随着电压增大，孔洞变为亲水性孔洞。在孔洞开放的时候，外源DNA容易通过孔洞进入细胞质。 噬菌体法： 鉴定转化细胞：抗生素抗性结合蓝白斑筛选法 6. 用冰预冷的1mL0.1M的CaCl2 处理、悬浮细 胞， 7 . 冰上20min 8. (取1.5mL)5000rpm离心5min，倾去上清 9. 100uL CaCl2轻轻悬浮，冰浴 实验流程 文库大小 以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下 N＝ln(1-p)/ln(1-f) N—基因组文库克隆总数 P—给定的概率， f—插入片段大小占总基因组大小的比例 基因组DNA文库的构建流程 RNA的评价与鉴定 OD260/OD280=1.8~2.0 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。 利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与PolyA杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以连抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。 2. mRNA的纯化 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图 3. cDNA的合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I