制备加压色谱资料.pptVIP

中分离得到口山酮类化合物。他们先将甲醇提取物用SephadexLH一20进行分离，所得富含糖苷的部位(300mg)继续用RP一18色谱柱进行中压液相色谱分离，共得到6个口山酮类化合物。所用的分离条件先由分析型HPLC分析确定。 表5．7归纳了用中压液相色谱对各类天然产物进行分离的一 5．1．1l色谱柱的过载和中心切割 为提高制备型分离能力，可使色谱柱超载(使质量或浓度超载。而非容积超载)。由于分离不是在线性条件下进行，最佳的分离条件无法再从分析型数据来预测。在利用“中心切割”技术进行分离时，需避免主要色谱峰前后两端微量组分的污染(图5．7)。 用这种方法进行分离，可能损失少量的a，但a的产量却可提高。在实际分离过程中，可逐渐加大上样量直至达到适当的超载程度，并通过中心切割得到一不受色谱峰前后杂质污染的产物。硅胶类固定相的超载量可由每克固定相超载样品lmg起开始摸索(Herbert，1991)。 为达到最大承载的目的，样品应尽可能溶在比流动相溶解能力差的溶剂中。 Farmakalidis和Murphy(1984)利用中心切割法从大豆中分离异黄酮类成分染料木苷(genistin)和大豆苷(daidzin)。也可用超载上样法从混合物中分离微量成分，如图5．8所示，通过切割超载上样的色谱柱得到一富含a的流分，对其再进行一次分离即可得到纯的化合物a。 5．1．12柱转换 柱转换一词包括改变流动相方向的所有技术。利用这类技术可使一根色谱柱的洗脱液流人另一根色谱柱(Ramsteiner．1988)。该技术具有以下优点： ——分辨能力和选择性得到提高 ——样品可在运转中纯化 ——将第一根柱得到的部分纯化的流分通过后续的柱色谱分离(包括循环色谱)可得到100％纯度的样品 ——微量的样品可得到富集 ——可以减少用于清洗色谱柱等所花的时间 利用转换阀可将第一根柱的一个流分注入第二根柱。在第二 根柱进行分离时，可同时用溶剂清洗第一根柱(Ramsteiner， 1988)。用该方法进行超载分离时十分有用，因中心切割所得组分可立刻被引入第二根柱，使其得到进一步纯化。Little和Sta． hel(1984)利用该方法从菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana) 叶子的水一甲醇提取物中直接分得甜味剂甜叶菊苷(Stevioside 5)。 他们先将干燥的植物叶子用甲醇一水80：20浸提，蒸干溶剂后，将提取物直接注入10tim Spherisorb ODS色谱柱(250×10mm)，用甲醇一水7：3洗脱。将通过中心切割所得含甜叶菊苷的流分经转换阀引入另一根相同的色谱柱，并以相同的溶剂进行洗脱，与此同时，用甲醇清洗第一根色谱柱，这样可为后面的分离省去很多时间。即使超载量不很精确(每次注射量30～50mg)，经过第二根柱的分离，也可获得纯的甜叶菊苷。 Okano等(1984)配合使用柱转换和循环色谱分离法从兔血浆中纯化25一羟基维生素D，。他们首先将要分离的物质通过硅胶柱(1)(图5．9)，洗脱液经过六通阀中的5’和4’流出。当需要时，使洗脱液经过5’和6’进入第二根硅胶柱。将含有维生素的流分在两根色谱柱间进行反复循环分离。可得到逐步纯化的样品。 5．1．13色谱峰的大小 色谱峰的大小不仅取决于样品中某个组分数量的相对多少 还与其光学性质有关。例如，混合物中一个主要的具有弱紫外吸收的组分可能被 一个很微量的、但具有很强紫外吸收的组分完全掩盖。根据色谱峰来收集流分可能导致主要组分的丢失。图5.10中所举的例子说明色谱峰的大小不能反映某个化合物的重要程度。 为避免在某一波长处可能产生的检测器超负荷，可再选用另似)，但由于操作的简便性及经济方面经常是首要考虑的因素。因此，快速色谱分离方法得到了普遍应用。 快速色谱的前身与人们熟知的短柱色谱非常近似(Hunt和Rigby，1967)，用这种短柱色谱分离混合物时可采用Merck公司的硅胶Kieselgel G(用于制备型薄层色谱的细硅胶)，并用瓶装氮气加压。常用的柱直径为3～10cm，长度为7～15cm。 快速色谱首先由Still等于1978年详细介绍，其目的在于缩短常压柱色谱的操作时间，该技术于1981年获专利保护(美国专利4，293，422)。色谱分离时进行长时间的洗脱有两个缺点： 敏感化合物可能被分解和色带容易拖尾，这两个问题在天然产物分离中经常会遇到。需要进行快速色谱分离的一个例子是对昆虫拒食活性成分柠檬苦素类(“monoids)化合物的研究。这些化合物在常压硅胶柱上会逐渐分解，只有配合使用快速色谱分离和半制备型HPLC技术才能获得纯品(Nakatani等，1994)。 图5．11为一典型的快速色谱分离装置。该装置