第三章重組dna技術.pptVIP

Edman發表了一種聚肽的順序切割法，這可能是目前蛋白質序列分析中，最重要的技術。末端胺基酸的移除，是經兩個步驟完成的。首先，胜肽在pH 8下，以異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate)處理，使末端胺基酸轉變為硫胺基碳酸苯的衍生物(phynylthiocaibamyl derivate)(PTC-太胜)。第二步是PTC-胜肽用無水的三氟醋酸(trifluoroacetic acid)處理，催化末端胺基酸環化為Anilino-thiazolinone的衍生物。 ? 五環的生成，是由於硫胺基酸上的硫原子，對第一個胜肽鍵上的羰基作親質性的攻擊，伴隨環狀封閉的，是第一個和第二個胺基酸間肽鍵的斷裂，在這種非水解狀況下，所有其他的肽鍵都保持完整。末端胺基酸的anilino-thiazolinone若用有機溶劑，可以從胜肽中萃取出來。胜肽中的胺基酸，如果有必要再進行切割，可重複地偶合和環化，直到所有的胺基酸都被移除。 ? 以Edman切割法逐步移除的胺基酸都被鑑定後，聚肽胺基酸順序就被建立了。移除的胺基酸，可用環狀衍生物直接測定，或者用胜肽與殘留的胜肽間胺基酸組成的差異間接測定。 DNA微陣列分析技術 DNA微陣列分析已被用在： １分析基因活性（表現）。科學家能決定出哪些 基因具有活性，比如說在一個特定的細胞，組 織或器官中，他們能找出基因表現的變化和物理 或生化過程的變化之間的關聯性，例如光合作用 在光波強弱不同的條件下的變化。 ２跟蹤基因體DNA的改變。許多實驗室利用DNA 微陣列分析技術來分析基因體DNA的改變。舉例 而言，分析發生在癌症細胞中DNA的改變。 重組DNA技術的應用 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第三章重組DNA技術 重組DNA技術（recombinant DNA technique）又稱遺傳工程，在體外重新組合去氧核糖核酸（DNA）分子，並使它們在適當的細胞中增殖的遺傳操作。 這種操作可把特定的基因組合到載體上，並使之在受體細胞中增殖和表達。 因此它不受親緣關係限制，為遺傳育種和分子遺傳學研究開闢了嶄新的途徑。  DNA的剪切與接合 重組DNA分子若少了下列兩類酵素則無法 輕易地製備： 限制內切酶就像一把剪刀在特定專一位置 上剪切DNA分子 DNA接合酶就像膠水般 可以將試管中的二段DNA接合在一起。 限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例： DNA限制片段的分離與觀察 瓊脂醣凝膠電泳是一種可以根據分子大小來分離DNA片段的技術。分離之後的DNA本身在膠體上是看不見的，經由溴化乙錠(ethidium bromide)的添加使得DNA泳動帶可以被觀察到。 DNA選殖 選殖的步驟包括： 分離DNA 把DNA接合到載體 把重組的DNA轉型到宿主細胞中 篩選含有重組DNA的宿主細胞 檢視含有重組DNA或是否產出適 當蛋白質產物的宿主細胞 選殖載體 選殖載體的條件： 具有複製起點，DNA才可以在宿主細胞中進行複製。 必須相當小才能在純化過程中不經裂解就可以分離得到。 具有許多單一特殊的限制酶作用位置以供選殖DNA片段 　使用，也因此載體將只被剪切一次，而且必須擁有許多 　可供插入DNA片段之限制酶作用位置可被利用。 具有選擇性的標記可以用來測定選殖媒介是否已轉移至 　細胞中或顯示外來的DNA是否已經插入至載體上。 細菌載體 質體(plasmids)： 質體具有多種的功能。有些可轉譯出一些提供對抗生素的抗藥性與細菌素～能抑制或殺死與其同類的細菌株或菌種等物質。另一些可提供生理上的功能，例如：色素的製造、化合物的裂解、雙氮的固定等。還有一些可以製造毒素且具有毒性的質體轉譯內毒素與溶血素，而有些質體則提供對金屬的抗性，例如汞、鎘、鎳、鋅。 噬菌體(bacteriophage) 可以感染細菌的病毒，我們稱之為噬菌體。病毒的DNA經由遺傳工程操作，已能當作選殖載體使用，最早被使用的是1974年的λ噬菌體。 其他生物體適用之載體 酵母人工染色體 細菌人工染色體 植物選殖載體 哺乳動物細胞載體 細胞轉形 利用電穿孔技術的方式可以將外來的DNA分子送入原生質體中：原生質體暴露在短暫的電流脈衝下，細胞膜暫時打開，使DNA分子得以進入細胞，開始轉形。 將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。 由於這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用,並且效率較高。 活體電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產生疏水或親水的微小通道105～115μm,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然後自行恢復。 在此期間生物大分子如DNA可通過這種微小的通道進入細胞。 近年來活體電穿孔法用於轉基因研究的報導不斷增多,