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第十七章 基因治疗 第一节 概 述 一、基因治疗的概念 基因治疗（gene therapy）——就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 对象： 体细胞 生殖细胞 二、基因治疗的必要条件 发病机制在DNA水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作 理想的基因治疗还必须： 外源基因可有效导入靶细胞 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 导入基因能适量表达 导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害 三、基因治疗的主要内容或策略 ㈠基因标记(gene labeling) Neo基因，逆转录病毒载体 ㈡基因置换（基因矫正） 定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列 ㈢基因添加（基因增补） 导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因 导入正常的基因补偿缺陷基因的功能 导入新的基因，利用表达产物治疗 ㈣基因干预(gene interference) 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。(mRNA,DNA) 导入寡核苷酸抑制内源基因的表达 反义核酸 封闭基因表达 核酶 裂解特异的靶mRNA 第二节 基因转移技术和靶细胞 基因治疗的基本方式： 体内直接转基因 体内法 in vivo 体细胞介导的基因治疗 回体法 ex vivo 基因转移的方法： 生物学方法 逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体 非生物学方法 脂质体，直接注射，受体介导基因转移技术，其它方法 一、基因转移的生物学方法 ㈠逆转录病毒载体： 逆转录病毒载体的结构 将病毒前DNA经适当改造并插入质粒后构建而成 5′LTR/ 3′LTR 包装信号（ψ序列） Neo基因/ Ampr 酶切位点（多克隆位点） 包装细胞(packaging cell) 将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒导入哺乳动物细胞，大量产生病毒包装蛋白。NIH/3T3 三代包装细胞： ψ—2 PA317 ψCRIP 逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转录出病毒基因组的部分序列、标记基因、外源基因，被包装成病毒颗粒。 缺陷型的逆转录病毒颗粒 一过性感染 病毒滴度106CFU/ml以上 逆转录病毒载体的特点： 缺陷型的逆转录病毒感染细胞 RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达 只能感染处于增殖期的细胞 安全性问题 逆转录病毒感染的可能性 污染的可能性 逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合 破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因 LTR激活原癌基因 染色体重排激活原癌基因 二、基因转移的非生物学方法 ㈠脂质体 ㈡直接注射 ㈢受体介导基因转移技术 ㈣其它方法 ㈠脂质体( liposome ) 脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。 其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。 人工脂质体膜具有如下特点： 与体细胞相容，无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03~50 ?m)，包容大小不同的生物活性分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求 ㈡直接注射 方法：注射，包埋 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%~30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS ㈢受体介导基因转移技术 受体介导的细胞内吞作用 特点： 具有细胞、组织或器官专一性，配体只能被一些特异的细胞吞噬 配体进入细胞的转移效率很高 核酸运载工具： 配体+多聚赖氨酸（PL） 配体—PL—核酸 脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）配体 肝细胞 受体 ㈣其它方法 磷酸钙共沉淀法 电穿孔法 显微注射法 基因枪法 三、基因转移的靶细胞 靶细胞的选择须考虑： 最好为组织特异性细胞 细胞较易获得，且生命周期较长 离体细胞较易受外源基因转化 离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活 目前常用的靶细胞有： 造血细胞 皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞 第三节 反义RNA、核酶和三链DNA在基因治疗中的作用 一、反义RNA ㈠反义RNA在基因治疗中的意义及需解决的问题 反义RNA与特异的mRNA结合而调控其翻译 体外合成反义RNA 构建转录反义RNA的重组质粒 ㈡受体介导反义RNA转移技术 ASGP—PL—反义RNA ㈢应用前景 安全性高 反义RNA设计和制备方便 具有剂量调节效应 能直接作用于一些RNA病毒 二、核 酶