实验二十三dna的体外连接.pptVIP

T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步： ①辅助因子ATP中磷酸基团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物； ②酶-AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸酯键； ③DNA链3’羰的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。 （3）温育结束时，加EDTA （pH 8.0）至终浓度为5 mM，混匀，于65 ℃加热60 min。然后用酚：氯仿抽提2次；上清液加0.1体积 3 M醋酸钠，充分混匀，再加2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后于-20 ℃放置15分钟。12000 rpm离心15 min，沉淀用冷70%酒精洗一次，风干后用20 ?l TE 溶解。 （4）完毕后各取1 μl DNA做电泳分析，0.8-1.5%琼脂糖凝胶，进行初步定量（同时还可以观察载体的酶切结果）。 * 实验二十三 DNA的体外连接（4学时） 一、实验目的 学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。 DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。 DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。 二、实验原理 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。 当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体5?-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。 三、实验材料 实验三所得的DNA片段，以及实验二所提取的载体质粒pUC19 DNA片段(500-1000 bp，带有EcoRI酶切位点), pUC19质粒(2686 bp), DL2000 标准分子量, EcoRI限制酶及 10×H buffer, 碱性磷酸酶（CIP），琼脂糖 T4 DNA ligase 及其缓冲液(TaKaRa, 350U/?l)，TBE缓冲液(10×)，溴化乙啶染色液(10mg/ml)，上样液(3×) 四、实验器具、药品试剂 恒温水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外透射检测仪，微量移液器，微量离心管； 五、实验方法 1. 载体的酶切和去磷酸化处理 在离心管中加入1 ? g pUC19 DNA, 10 ?l 10хEcoRI缓冲液,加双蒸水至50 ?l ，最后加入20 U EcoRI酶，充分混匀，离心30 s，在37 ℃恒温保温30 min。 加入5 ?l 1M Tris-HCl (pH9.0, 1 U CIP,充分混匀，离心30 s，在37℃恒温保温，60 min。（加pH9.0 的Tris-HCl 缓冲液, 目的是将pH7.5-8.0的酶切缓冲液的pH调到适合 CIP的pH8.5左右 ）。 *