设计重组载体时的注意事项.pptVIP

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2016-11-05 发布于天津
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设计重组载体时的注意事项.ppt

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设计重组载体时的注意事项

实验十载体构建实验目的：能够综合运用DNA回收、酶切、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定筛选重组质粒等分子生物学技术。设计重组载体时的注意事项目的DNA插入克隆载体在克隆载体的MCS中选择合适的酶切位点：通过引物设计在目的片段两端加上酶切位点注意在外源DNA片段的内部不会出现这些酶切位点目的DNA插入表达载体除上述注意事项，引物设计时还要注意读码框要和表达载体的读码框一致实验流程第一天：电泳PCR产物并回收双酶切目的片段及质粒电泳检测、回收上述两种DNA 电泳检测回收产物连接反应（过夜）空闲时间准备LA（含50μg/ml氨苄青霉素）平板，LB培养基，试管及牙签灭菌。 HindIII、EcoRI双酶切50 μl体系待酶切DNA：不超过2.5 μg 10×Y buffer: 10 μl （工作液浓度为2×) EcoRI: 1 μl HindIII: 1μl -1.5 μl 加ddH2O至总体积为50 μl 37℃孵育≥1小时 T4 DNA 连接酶 20 μl体系 pUC18 200-400ng 待插入的DNA片段 10 × buffer：2 μl T4 DNA 连接酶： 1.5 μl 加ddH2O至总体积为20 μl 15℃孵育4-18小时或室温3小时或 4 ℃ 过夜 * 第二天：下午做转化实验第三天：保存平板，留待下周提质粒鉴定电泳鉴定或 PCR鉴定 2000 1000 2000 1000 （加样量同marker）目的片段乙组提pUC18 20ng/μl 原始pUC18 原始pUC18 载体与插入片段的摩尔比： 1: （3~10） *