基因片段与载体连接.ppt.pptVIP

普通Taq酶会在3′末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3′端均有一个单链状态的A； T－载体是线状DNA片段，在DNA双链的3′端均有一个单链状态的T； 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。 * * 两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。?T4噬菌体DNA?连接酶催化DNA?连接反应分为3?步：首先，T4?DNA?连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 基因片段与载体连接及重组子的转化 邱逸敏 基因工程与发酵工程教研室 基因片段与载体连接 一、实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是DNA片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 二、DNA分子的体外连接原理 DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列（粘性末端）基础上进行的。 连接反应中值得注意的几个问题： 1.DNA连接酶 常用的DNA连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的DNA连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ4 DNA连接酶。 二者的作用机理类似。 T4 DNA连接酶作用机制 Ｔ4连接酶作用分三步： １．Ｔ4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。 ２． 酶－AMP复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 2.连接反应的温度 DNA连接酶的最适反应温度为37℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是16℃。 3. DNA的平未端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的， 4.碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。 5.连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端操作。 三、实验试剂 １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ4 DNA连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA ３．Ｔ4 DNA连接酶 ４．5mM ATP 四、实验方法 DNA分子的体外连接 １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： 10×T4 DNA Ligase Buffer DNA片段 载体DNA T4 DNA Ligase dH2O 1 ul 约0.3pmol 约0.03pmol 0.4ul up to 10ul ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 ３．１6℃下连接反应30min。 ４．反应结束后进行转化。 DNA分子的体外连接： 阳性对照： 五、结果