大肠杆菌碱性磷酸酶akp基因的克隆表达(生物综合实验).pptVIP

大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达(生物综合实验) 大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达实验内容 1、生物综合实验基本说明及试剂配制（7周） 2、质粒DNA的提取及其定性定量分析（8周） 3、大肠杆菌基因组DNA的分离及AKP基因的PCR扩增（9周） 4、质粒DNA与目的DNA的重组（10周） 5、感受态细胞的制备和重组质粒的转化（11周） 6、重组子的筛选、鉴定及发酵培养（12周） 7、重组蛋白的检测分析（13周） 8、重组蛋白的分离纯化与功能鉴定（14周） 大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达实验考核方式 出勤率10% 实验操作15% 实验习惯10% 实验报告65% 注：实验报告按中山学院毕业论文格式写，本综合实验完成后将从中抽取3-5名优秀的实验报告推荐成为毕业论文。 Contents 载体（Vector） 在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 作为载体必需的条件： ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制； ②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，可适于多种限制酶切割的DNA插入； ③有一定的标记基因，便于进行筛选。 载体（Vector） 载体（Vector） 载体（Vector） 载体（Vector） 载体（Vector） 载体（Vector） PCR基因扩增 PCR基因扩增 PCR基因扩增 PCR基因扩增 RT-PCR(reverse transcription-PCR)主要用途：分析基因的转录水平/获取目的基因/合成cDNA探针 PCR基因扩增 反向PCR (Reverse PCR) PCR基因扩增 非对称PCR(asymmetric PCR)：引物不等量，最后扩增ssDNA 多重PCR(multiplex PCR )：多对引物扩增几个DNA片段 PCR基因扩增 套式PCR (Nested PCR) PCR基因扩增 实时定量PCR(real-time quantitative PCR) PCR基因扩增 PCR基因扩增 DNA重组 DNA重组过程 基因分析与检测 基因分析与检测 印迹法 基因分析与检测 DNA序列测定 原理： Sanger双脱氧终止法 基因分析与检测 DNA序列测定 基因分析与检测 基因分析与检测 分子杂交法 基因分析与检测 基因表达 基因表达 不同表达系统的比较 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化 组氨酸标签蛋白的纯化 大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达主要实验步骤 Click to edit company slogan . 培养 培养 破壁 复性 难点 较好 好 较好 差 稳定性 高,主要花费在培养条件方面 高,主要花费在培养条件方面 低 高,主要花费在纯化方面 生产成本 纯化较简单(家蚕除外) 纯化简单 胞内表达破壁困难,分泌物纯化工艺简单 细胞破壁容易,多数产物需复性,工艺较复杂 产物纯化工艺 能糖基化,但糖基化程度与天然产物有差别 糖基化好,近似天然产物 能糖基化,但糖基化程度与天然产物有差别 不能糖基化 表达产物的糖基化 一般都能分泌 一般都能分泌 多数能分泌,少数在胞内形成包含体,有时产物不均一 多数不能分泌,胞内形成包含体 表达产物的形式 较难 难 易 易 培养条件 不高(家蚕除外) 不高 比较高 高 外源基因表达水平 昆虫细胞 哺乳动物细胞 酵母菌 大肠杆菌 比较指标 原材料的处理 粗制分离 精制分离 蛋白质 破碎、离心 盐析、等电点、 有机溶剂、PEG 层析、超滤 脱盐、浓缩、 干燥、保存 LOGO 载体 1 PCR基因扩增 2 DNA重组 3 基因分析与检测 4 基因表达 5 蛋白质的分离纯化 6 动物病毒 质粒 噬菌体 Cosmid YAC 常用的载体 按来源分 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。 能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体，即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。 克隆载体 表达载体 穿梭载体 按作用分 PCR原理 引物 dNTPs 模板DNA 耐热DNA 聚合酶 缓冲液 PCR反应体系 基本构成 PCR应用 实时定量PCR RT-PCR 反向PCR 非对称PCR 多重PCR 套式PCR 锚定PCR SYBR GEEN Ⅰ 筛选 转化 连接 酶切 分析检测方法 DNA序列测定 印迹法 分子杂交法 PCR法 标记筛选 酶切图谱分析 DNA序列测定 耐药性选择 Β-半乳糖苷酶显色反应选择 营养标记选择 PCR法 酶切分析 标记筛选 原核表达 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌 基因表达 真核表达 酵母菌 丝状真菌 哺乳动物细胞 植物细胞 昆虫细胞 如何选择载体?