第七章载体.ppt

基因工程为什么需要载体? 因为: 单独一个“启动子+编码区+终止子” 不易进入受体细胞;不容易在细胞内维持; 载体定义 通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。 载体功能 在基因操作过程中使用有两个目的： 一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去； 二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。 必备条件 ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有制复起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。　 作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因(replicator） 选择性记号 多克隆位点 多克隆位点 DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 按克隆载体的来源分： 质粒～ 病毒或噬菌体～ 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～ 质粒与染色体DNA片段组成的～ 现在所用的载体主要有两类： 一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。 另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。 第七章 载体 1 质粒载体 1.1 质粒的一般生物学特性 1.2 基因工程中的质粒载体 1.3 pBR322质粒载体 1.4 pUC质粒载体 1.5 穿梭质粒载体 1.6 质粒载体的稳定性问题 1.7 构建质粒克隆载体 1.1 质粒的一般生物学特性 1.1.1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于宿主染色体外、具有自主复制能力的双链小核酸分子(DNA)，大小范围在2kb-200kb以上不等。 多数在10Kb左右。 1.1.2 质粒的一般生物学特性 (1) 很多细菌中已发现； (2) 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； (3) 大多数质粒的宿主范围较窄； (4)已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 (5)复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质； (6)常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。 1.1.3 质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 1.1.4 质粒给宿主细胞的标记 (1) 氨苄青霉素 (Ampicillin ) (2) 卡那霉素 (Kanamycin) (3) 四环素（Tetracycline） (4) 氯霉素(Chloramphenicol) (5) 链霉素（Streptomycin） (6）潮霉素（Hygromycin ） 1.1.5 质粒的复制类型 据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： （1）“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷贝数少 ； （2）“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷贝数多。 1.1.6 质粒DNA的转移 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid):含有tra基因，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质转移。 非接合型（non-conjugative plasmid)：不含有tra基因，不会自行发生接合转移，比较安全。 构建克隆载体的质粒一般用哪一种？ 1.1.7 质粒的转化 1.2 基因工程中的质粒载体 1.2.2 克隆载体必备条件 1.2.3 表达载体的必备条件 (1)能自主复制 (2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记 (3)具有能为 RNA聚合酶识别的强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控 (5)具有强终止子 (6)具有翻译起始信号 1