5核酸化学要点.pptVIP

甲基鸟苷5’，5’-三磷酸 ●由甲基化酶催化 ●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。 ● 可为核糖体提供识别位点。 5′ “帽子” ? 3’-端有一段约200核苷酸的polyA。 ●转录后由poly(A)聚合酶催化加尾 ●PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 ●polyA与mRNA半衰期有关， PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。 一、核酸的溶解性质二、核酸的紫外吸收（λmax=260nm） 三、核酸的变性、复性和分子杂交 四、核酸的沉降性质 五、核酸的水解 六、核酸研究技术 Section5 核酸的性质及核酸研究常用技术 ★ 一、核酸的溶解性质 　均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中形成沉淀； 　　　　　　　 0.14M Nacl 1～2M Nacl DNA-蛋白 溶解度低 溶解度高 RNA-蛋白 溶解度高 溶解度低 ★二、?核酸的紫外吸收 　 碱基有共轭双键，使得碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm （ 蛋白质：λmax=2８0nm） 核酸的紫外吸收受PＨ的影响，应注意在一定的ＰＨ下进行。 DNA的紫外吸收光谱 1　天然DNA 2　变性DNA 3　核苷酸总吸收值 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白，则A260/A280比值明显降低. ★三.核酸的变性、复性和杂交 1.变性（denaturation）：在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，碱基堆积力破坏，双螺旋解开，变成随机卷曲的两条单链（不涉及共价键断裂）的过程。 变性因素：加热、酸、碱、变性剂、有机试剂 变性后的理化性质 ： A260增加（增色效应 ） ；粘度降低；沉降系数增加；浮力密度升高。 DNA的变性过程 加热 部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对 2.Tm：熔解温度（melting temperature） DNA的热变性发生在一个很窄的温度范围内。 热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。 DNA的Tm一般在70-85℃之间。 Tm Tm的大小与DNA分子中（G+C）的百分含量成正相关。 Tm =69.3 +（G+C）% × 0.41 Tm与碱基组成、离子强度及PH的影响 某些DNA的Tm值 60 80 100 1 .0 1 .4 1 .2 100% A260 t \ 0C Tm Tm Tm 1 2 3 Poly d(A-T) DNA Poly d(G-C) 1 2 3 离子强度越高， Tm越高。 因此，DNA样品不应保存于很稀的盐溶液中，1mol/LNaCl PH影响碱基的解离，丧失形成氢键的能力。 变性（加热） 探针 杂交（缓慢冷却） 复性（缓慢冷却） 3.复性renaturation 在一定条件下（一般低于Tm 25℃） ，变性DNA 单链间互补碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。 热变性DNA缓慢冷却过程中的复姓称为退火。最佳退火温度比Tm值低25℃. DNA大小、浓度及离子强度影响复性速度。 4.分子杂交（ molecular hybridization） 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间互补的碱基对，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交。 制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测、鉴定和表达研究。 Southern印迹法 Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位； Northern印迹法 Northern Blotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA； Western Blotting 抗原与抗体的杂交，研究基因表达产物常用技术。 分子杂交的原理示意图 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 四、核酸的沉降性质 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），浮力密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。 这一方法常用于不同DNA的纯化。 五、核酸的水解 酸水解（DNA）和碱水