荧光定量PCR(徐歆改)要点.pptVIP

实验七 荧光定量PCR 简 介 荧光定量PCR扩增曲线 荧光定量PCR扩增曲线并非标准的指数曲线，而是S形曲线，并可分为反应早期、指数期和线性期和平台期。 即使是重复实验，保证各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也有所不同 PCR结束后的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况 Ct值与DNA模板 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，CT值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 非特异性荧光标记 SYBR Green I 游离状态荧光很弱，但与DNA双链结合后荧光强度增加1000倍！ 其信号强度代表了双链DNA分子（即PCR产物）的数量 熔解曲线分析引物二聚体 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针 绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度 相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化 拷贝数的计算 样品DNA浓度（ng/μl）= OD260×40×稀释倍数 样品分子量 = 质粒碱基对总数 × 660 拷贝数（copies/μl）= 样品DNA浓度/样品分子量 × 6.02 × 1014 倍比梯度稀释方法 梯度1：原液（106 copies/μl ） 梯度2：1份原液+ 9份稀释缓冲液， 105 copies/μl 梯度3：1份梯度2溶液+ 9份稀释缓冲液， 104 copies/μl 梯度4：1份梯度3溶液+ 9份稀释缓冲液， 103 copies/μl 梯度5：1份梯度4溶液+ 9份稀释缓冲液， 102 copies/μl 梯度6：1份梯度5溶液+ 9份稀释缓冲液， 10 copies/μl 以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作标准曲线 管家（内参）基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因，不随外界刺激发生变化或变化不大 常用的有：beta-actin，GAPDH，18SrRNA等 原理：以管家基因的表达量为参照，定量目的基因的表达量 前提：管家基因与目标基因的扩增效率相似且接近100% 方法：2 - △△ CT（Livak）法 用管家基因的CT值归一目标基因的CT值： △ CT＝目标基因的CT －管家基因的CT 用对照组的△ CT值归一处理组的△ CT值： △△ CT＝处理组△ CT －对照组△ CT 相对表达水平比率= 2 - △△ CT（对照组为1） 相对定量 ABI 7500 Real-Time PCR System 注意事项 操作：取/拿PCR单管/8联管/96孔板时，切勿触碰管盖或光学贴膜，最好戴一次性手套操作，勿在盖子或贴膜上编号； 加样：同时检测多个目标基因，应先将模板预混入大体系中，分装至小管后，再加入各目标基因引物； 模板浓度：基因组DNA在50ng-5pg之间，质粒DNA在106拷贝数左右。RNA应在1pg-1μg之间。一般而言，使CT位于15~30个循环比较合适； 对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照。 谢 谢!!! * * 定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此确定初始模板的数量。 荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。 1996年由美国Applied Biosystems公司推出该技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点 荧光定量PCR的优点 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数 同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，但指数期产物量相同 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光信号之后进入指数增长阶段。软件自动给出，无需手动设置。 荧光域值（ Threshold ）为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（或本底的2倍）。软件自动给出，可