细胞凋亡检测要点.pptVIP

三、细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞计数法 细胞生长曲线 细胞分裂指数 克隆形成率 1、细胞计数法 细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。 台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。 注：台盼蓝染色——排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能拒染，因而不易着色。 结果分析 细胞密度 细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/ 4 ）×104×稀释倍数 细胞存活百分率 细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％ 2、细胞生长曲线 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖 方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24 h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数为纵坐标，即为该细胞的生长曲线。 方法二：四氮唑盐（MTT）比色法 3、细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标；以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。 方法：染色后血细胞计数板计数 细胞分裂指数＝细胞分裂相数/细胞总数（1000）×100％ 4、克隆形成率 克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，反映细胞群体依赖性和增殖能力。 各种细胞克隆形成率差别很大，一般初代细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 方法 克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％ 注意：细胞要分散好，不能有细胞团，接种密度不要过大。 四、细胞生物活性的化学检测法 四氮唑盐（MTT）比色法 细胞蛋白质含量测定法 细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验 细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验 1、四氮唑盐（MTT）比色法 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪，在490，570 nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。 2、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法） 原理：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合后，在595nm波长处呈现最大吸收量，其吸光值与蛋白质含量呈正相关。 此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。 3、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入实验 原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用核素标记氨基酸，如3H-亮氨酸，可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。 4、细胞DNA合成的3H-TdR掺入实验 原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用核苷3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。 五、细胞凋亡检测方法 （一）、凋亡概念： 细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即是由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。 接受凋亡信号 凋亡调控分子间的相互作用 蛋白水解酶（caspases）的活化 凋亡的级联反应 Model for caspase activation by mitochondria. Multiple apoptotic pathways emanate from the mitochondria. 光学显微镜观察 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 6. 凋亡的效应分子检测 细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。 半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的词头) Caspase家族的结构与分类 ICE亚类Caspase蛋白酶：IC