第十章层析.解读.pptVIP

图10.5 ◆离子交换基本原理 ★有高度的不溶性；而在各种溶剂中进行交 换时，交换剂不发生溶解 ★有疏松多孔的结构或巨大的表面积，能使 交换离子在交换剂中进行自由扩散和交换 ★有较多的交换基团 ★有稳定的物理化学性质，在使用过程中， 交换剂不能因物理或化学因素的变化而发 生分解和变形等现象 ◆离子交换剂应具备的条件 ◆离子交换剂类型 离子交换树脂 (疏水型) 阳离子型 强酸型 弱酸型 阴离子型 强碱型 弱碱型 多糖基离子交换剂(疏水型) 纤维素离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂 琼脂糖离子交换剂 ◆阳离子树脂：强酸性活性基-SO3H（磺 酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）； 弱酸性活性基-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等 ◆阴离子树脂：强碱性活性基为季铵基团： 如三甲胺基或二甲基-?-羟基乙基胺基； 弱碱性活性基团为伯胺或仲胺 ◆常用亲水性离子交换剂：CM-纤维素，DEAE-纤维素，CM-交联葡聚糖，DEAE-交联葡聚糖CM-Sepharose CL-6B磷酸纤维素， ◆基本原理：将具有亲和力的两个分子中的一个固定在以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。 五、亲和层析法 10.6 ◆定义：亲和层析是利用待分离的生物大分子和它的特异性配体间具有的特异亲和力，使之与杂质成分分离的一类特殊层析技术。 ◆具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA、糖蛋白-植物凝集素等。 ◆主要用于生物大分子（蛋白质、抗体、 激素、维生素、核酸、病毒、细胞等） 的分离、纯化。 10.4 层析操作方法 一、柱层析 ◆基本装置 * * 第三部分 均相体系分离技术 第十章 层析分离技术 10.1 概述 ◆层析法也称色谱法，1906年俄国植物学家Michael Tswett将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，故命名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 图10.1 层析发明示意图 图10.2 植物色素分离示意图 色谱法的发展历程 ◆1903年Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。但分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸 色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了以气体为流动相的气相色谱法（gas chromatography,GC) 其应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料、高压输液泵和高灵敏度监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy, HPLC）。 层析方法分类 ◆根据流动相的状态： 液相层析：以液体作为流动相 气相层析：以气体作为流动相 进而按传质的两相状态： 液相层析 液-固层析液-液层析 液相层析 气-固层析气-液层析 ◆根据操作形式分： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一 个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后， 用流动相展开，以达到分离鉴定 的目的。 薄膜层析：固定相为适当高分子有机薄 膜，操作同纸层析。 薄层层析：将适当粒度的固定相铺成薄 层，操作方法类似纸层析。 ◆ 根据层析机理： ?吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 ?分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数不同实现分离。 ?离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同分离。 ?分子筛层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的差异分离。 ?亲和层析法：利用固定相只能与待分离组份的专一亲和力与其它组份分离。 层析法的特点 （1）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）分析速度快。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱 分