聚丙烯酰胺凝胶电泳.解读.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis；PAGE） 作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。 电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致） 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native） (根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质） 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） （根据亚基分子量分离蛋白质） SDS与非变性凝胶电泳相比，具有较高的分辨率。 根据其有无浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 连续电泳 电泳体系中所用的缓冲液成分、 PAGE pH、凝胶浓度相同 不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及 电位梯度呈不连续性 电荷效应 分子筛效应 浓缩效应：不连续性所致 1 、材料与试剂 2 、样品 3 、操作方法 4 、相对分子质量的计算 5 、注意事项 6 、讨论 7 、附录 1 、材料与试剂 1.1 30%的丙烯酰胺 分别称取29g 丙烯酰胺，1g N,N -亚甲双丙烯酰胺加温热的去离子水60ml，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml，过滤，即配成30%（w/v）丙烯酰胺贮存溶液，置于棕色瓶中4℃保存，一般可放置1个月。 1.2 10%十二烷基硫酸钠（SDS） 称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃，加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml，即为10%（w/v）SDS。 1.3 浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8） 称取12.12g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至6.8,再加去离子水至100ml。4℃保存。 1.4 分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8） 称取18.16g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至8.8, 再加去离子水至100ml。4℃保存。 1.5 10%过硫酸胺（AP） 称取过硫酸胺 0.1g溶解在1.0ml超纯水中，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。（也可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可） 1.6 TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺） TEMED作为催化剂，通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。 1.7 Tris-甘氨酸电泳缓冲液pH8.3 称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1g，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 1.8 样品处理液 1mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液 0.5ml、10%SDS 2ml、1mol/L二硫苏糖醇DTT 0.5ml、溴酚蓝 0.1g、甘油 1ml、H2O1ml。 1mol/LDTT：称取100mgDTT溶于0.65ml的水中。 1.9 染色剂配制 0.1%