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聚合酶链反应技术 Polymerase Chain Reaction 主要内容 第一节 聚合酶链反应技术的原理 第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化 第三节 聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术 第四节 荧光定量聚合酶链反应技术 第五节 聚合酶链反应方法的标准化 第一节 聚合酶链反应技术的原理 一、聚合酶链反应技术的简史 Watson、Crick：DNA双螺旋结构 Meselson、Stahl:半保留复制模型 Khorana：最早提出体外扩增核酸的设想 Kary. B. Mullis：发明聚合酶链反应 Saiki：发现耐热DNA聚合酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min， 2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （六）PCR一般方案 1．50 ul PCR反应体系的组成 1）组成： ①样品DNA 0.1～1ug； ②正链引物（25umol/L）1.0ul； ③负链引物（25umol/L）1.0ul； ④脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul； ⑤10×PCR缓冲液 5.0ul； ⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul； ⑦Taq DNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸馏的去离子水补至50ul。加入30ul石蜡油，短暂离心混匀。 2）对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。 2．PCR仪工作参数的设置 94℃ 30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循环30次，最后72℃延伸5min。 3．PCR产物的保存与检测 PCR产物于4℃保存，PCR产物检测。 四. PCR扩增产物的检测方法 (一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途 特点： 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 上样量远大于琼脂糖凝胶； 回收的DNA纯度高； 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。 用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。 (二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息 点杂交（dot blot） 原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。 探针： 放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。 非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快 用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 反向点杂交(reverse dot blot) 原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。 探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。 用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。 结果分析： 正常纯合子 突变纯合子 杂合子 Southern印迹杂交(Southern blot) (四) PCR-ELISA 引物采用双标记，即一个引物5’端标记便于PCR产物固定的功能基团（如生物素），另一个引物5’端标记便于PCR产物检测的基团（如地高辛、荧光素等）。 本法避免了电泳和杂交的步骤，适用于常规ELISA记数仪检测 (五) 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP） 本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于