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第十章 有机高分子基质的高效 液相色谱分离柱填料 韶关学院生物科学系 第一节 概述 HPLC是现在生物分离分析的重要手段，具有分离效率高、选择性好、适应面广（对被分离物质大小、含量、性质和操作方法）、产品纯度高和重复性好等特点。 HPLC的核心是在于分离柱填料。 HPLC的分类按分离机理：基于吸附分配的反/正相及疏水色谱，基于电荷作用的离子交换、基于空间排阻的凝胶层析/凝胶渗透，基于生物特异作用的亲和色谱等。 按填料性质分：有机和无机填料色谱。 有机填料的优越性： ① 以多糖和有机基质骨架，易于改性。 ② 理化稳定性好，耐酸、碱和溶剂，反复使用。 ③ 生物相容性好，非特异吸附少。 ④ 高负载，高容量。 非常适合生物活性分子，有机高分子的刚性普遍不如无机填料，淋洗过程会膨胀或皱缩。 第二节 有机高分子类型HPLC填料的结构特性 一、填料的物理结构 填料的色谱动力学受粒度及粒度分布、孔径与孔径分布、粒度强度和表官形态等影响。 色谱对填料在物理性质上的要求： ① 合适的粒度大小和狭窄的粒度分布范围，能单分散最好。② 刚性好，一定的颗粒强度，满足高速高压操作要求。③若为多孔结构填料，除达到孔径大小和分布外，尽量避免形态复杂的微孔结构。④使用时填料融胀/收缩不能超出规定用允许范围。 常用HPLC填料按物理形态可分为： 1、多孔型 又分小孔10nm; 中孔10-30nm; 大孔30nm; 超大孔100nm。 2、非多孔型 整体颗粒无孔。 3、薄壳型 内部无孔，表面层为多孔结构。 实践上以高负载量的多孔型最常用，特别是大孔和超大孔gel。 颗粒大小也各不一样，工业化生产中使用大粒度填料便于操作。上世纪80年代以来，填料研究在一些方面取得了可喜的进步：①颗粒单分散填料 ②具贯穿性超大孔结构填料 如贯流色谱填料颗粒含600-800nm贯穿孔，贯穿孔内连接80-150nm的扩散孔。③小颗粒非多孔填料 避免了非特异性吸附，效率高时间短。 二、填料的化学结构 色谱的化学热力学行为决定于其填料化学结构（特别是颗粒外表面和内孔表面化学结构）。既要有选择性分离的化学结构，又要良好的化学和热稳定性以及极低的非特异性吸附。 HPLC填料按结构分为： 1、离子交换色谱填料 颗粒表面带某种电荷的可交换基团。 2、反相色谱填料 颗粒表面含C8、C18烷基/苯基强疏水基团/链段。 3、正相色谱填料 颗粒表面含羟基、氨基、羧基醚链等极性基团/链段。 4、疏水相互作用色谱填料 颗粒表面含C1、C4烷基、笨基、PEG等弱疏水基团/链段。 5、空间排除色谱填料 有亲水和亲油2类，用于水相体系的含羟基的亲水基团；非水相的含疏水基团。 6、亲和色谱填料 颗粒表面带特异性配基。 对基质材料经过化学修饰，才能制备成合适的色谱填料，满足不同色谱技术的需要。 第三节 有机高分子类型HPLC填料的基质树脂 基质材料/载体 是色谱填料的支撑骨架，决定填料的颗粒大小与分布、颗粒强度、孔径大小与分布、孔的结构形态、颗粒内部的化学结构和其稳定性等，也影响对颗粒表面的化学修饰的实施。常见有机高分子类型填料的基质树脂可分为： ①多糖型 天然多糖原料用物理方法加工成微珠并交联成凝胶。 ②聚合物型 将合成单体/交联剂用化学聚合成交联高聚物微球。 一、多糖型基质材料 亲水性树脂无须改性可直接用于凝胶过滤色谱 1、葡聚糖系凝胶 由葡聚糖和环氧氯丙烷偶联制成。早期的软凝胶系列Sephadex G-x，强度低，粒度分布宽，改进型有高交联羟丙基化葡聚糖 Sephasorb HP Uitrafine 以及烯丙基葡聚糖和甲叉双丙烯酰氨交联共聚凝胶 Sephacryl系列，刚性好，柱压低适合高流速色谱。 2、琼脂糖系凝胶 传统的Sepharose，Bio-gel A，Ultragel A软胶系列。改进型Sepharose CL系列， Sepharose Fast Flow， Sepharose High Performance等。 二、聚合物型基质材料 比多糖型凝胶的机械强度大，化学性质更稳定，更适合于高速高压的HPLC操作。按结构形态分为多空型和非多空型；按性能分有亲水及疏水凝胶。 1、交联聚苯乙烯树脂 苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物微球，Rohmhaas 的AmberliterXAD系列、Hamilton Co. 的PRP-1、 Hitachi gel 3010、3011系列等。具颗粒小而均匀，单分散，贯穿性超大孔的特性。 不改性的这类树脂也可用于色谱操作。 2、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂 以甲基丙烯酸的甲酯、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等为原料为单体制备的多型高联高聚物微球。Spheron、 S