分子标记及基因芯片技术与应用解析：.pptVIP

10 分子标记及基因芯片技术及应用 10.1 分子标记技术和应用 10.2 基因芯片技术及应用 10.1 分子标记技术和应用 概述 RFLP AFLP RAPD SSR和ISSR SSCP SNP A 分子标记概述 遗传标记的种类： 形态标记 细胞标记 生化标记 分子标记 形态标记 是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。 细胞标记 是指明确显示遗传多态性的细胞学特征。 生化标记 是指明确显示生物大分子或生物化合物多态性的生化特征。 分子标记 广义的分子标记：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记。 狭义的分子标记只是指DNA标记。 目前已开发的分子标记技术 各种分子标记的特点 （1）直接以DNA的形式表现，不受季节、环境限制； （2）数量多，遍布整个基因组； （3）存在共显性分子标记； （4）选择中性，不影响目标性状的表达； （5）检测手段简单迅速，可分析微量样品 B. RFLP (restriction fragment length polymorphism )限制性片段长度多态性 DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变化。 RFLP操作 RFLP与性状的连锁 RFLP带谱的分析 RFLP特点 共显性（能够区分杂合子和纯合子）； 无组织特异性，不受环境影响； 数量丰富 需要仪器设备多，试验操作复杂； DNA需要量大； 大多数RFLP表现为二态性，提供信息量低； 需要选用恰当的限制酶，才能表现较好的多态性。 C. AFLP （ amplified fragments length polymorphism ）扩增片段长度多态性 集合了RFLP和PCR技术的优点。 AFLP的特点 标记丰富：使用少量引物得到大量标记； 高分辨率； 两步PCR扩增，高效，高灵敏度，重复性好； 不需要事先知道DNA序列，也具有通用性。 费用高，操作复杂； 绝大多数显性标记，不能区分杂合子和纯合子 对DNA模板质量、内切酶质量要求高（酶切充分）。 D. RAPD (random amplified polymorphic DNA)随机扩增多态性DNA 以基因组DNA为模板，采用随机设计的单个寡核甘酸序列（6-12bp）为引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，用于检测DNA序列的多态性。 RAPD的数据分析 RAPD的特点 不需要探针，不需要已知DNA信息； 对DNA需要量少，对质量要求不高； 技术简单，分析自动化，成本低； 操作简单，无放射性物质，检测速度快，成本较低； 可以转化为SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）标记。 显性遗传，不能区分纯合子和杂合子; PCR敏感，重复性差； 存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的片段; 需要筛选多态性高的引物。 E. SSR和ISSR SSR（simple sequence repeat）：简单重复序列多态性，又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象。 ISSR(inter-simple sequence repeat)：:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。 SSR ISSR 检测手段： PAGE—高分辨率 SSR和ISSR的特点 多态性丰富，所需DNA量少 共显性, 故可鉴别杂合子和纯合子； 操作简单，稳定可靠. 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点. 开发成本高，或需要对目标生物具有一定的前期研究基础. SSR资源的挖掘 构建基因组或cDNA文库 EST数据库搜寻法 利用物种保守性 微卫星富集文库 F. SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism) 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同. 电泳检测SSCP 测序检测SSCP SSCP特点 原理及操作简便,周期短。 成本低,所用试剂价格相对低廉。 适用于大样本筛选,常规方法在研究基因突变时需DNA 测序,SSCP技术在测序前对DNA 样本进行筛选。 对 DNA 原始材料纯度要