基因工程第四章教程分析.ppt

本章目标 掌握：基因工程常用技术的原理与方法 1. DNA提取 2. 琼脂糖凝胶电泳技术 3.杂交技术 4. DNA序列测定技术 5. PCR技术 重点：PCR技术、琼脂糖凝胶电泳、Sanger 双脱氧链终止法测序的原理及过程。 难点： Sanger双脱氧链终止法测序的原理 作业：P95 1、3、6、7、8、11、12 * [医]Har GobindKhorana,印度出生的美国化学家，1922年生，因发现在遗传情况下酶对细胞功能所起决定作用的过程而与Robert William Holley和Marshall Warren Nirenberg共获1968年诺贝尔医学生理学奖； [人名] 霍拉纳 * 同义引物（Sense），反义引物(anti-sense)， * 随机引物为一组6个核苷酸随机组成的寡聚物,几乎包含所有6核苷酸的序列。 （1）制备单链DNA模板 2. 技术要点 就是待测序的 DNA链。 ①不能有5’?3’和3’?5’的外切酶活性； ②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。 （3）特殊的DNA多聚酶 dNTP / ddNTP = 100 / 1 （4）制备2’和3’双脱氧的ddNTP 时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。 需带有放射性或荧光标记。 （2）制备一小段单链引物（DNA或RNA） 3. Sanger双脱氧终止法测序过程 模板序列 1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。 二、Maxam-Gilbert化学修饰法 Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖 末端放射性标记 的DNA片单链 长度只差一个核苷 酸的DNA链混合物 化学试剂处理 凝胶电泳 放射性自显影 阅读碱基顺序 特定的碱基中 引入化学基团 DNA在被修饰的 核苷酸位置断裂 1. 原理 碱基 特异修饰方法 G pH8.0,用硫酸二甲脂对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 A+G pH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 C+T 肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去 C 在1.5mol/L NaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶 2. 碱基特异的化学修饰法 4. 测序过程 每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。 特点： 读出的序列就是要测的序列。 Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。 测序读片 90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。 1. 原理 （1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形 成完全的双链分子。杂交效率最高。 三、DNA杂交测序 （2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。 （4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。 8mer探针有48= 65536 种序列。 如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。 （5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。 5’-AGCCTAGC-3’ Target 3’-TCGGATCG-5’ Probe 假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。 但： 12mer靶DNA 与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。 3’-TCGGATCG-5’ 3’-CGGATCGA-5’ 3’-GGATCGAC-5’ 3’-GATCGACT-5’ 3’-ATCGACTT-5’ 5’-AGCCTAGCTGAA-3’ 12-mer target 8-mer probe 假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。 （1）DNA芯片（chip） 把寡聚核苷酸探针的3‘端或5’端与玻璃或凝胶形成共价连接。 目前可以做出65536 种8-mer探针芯片。 2. 技术要点 每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。 DNA chip 杂交 （1）非放射性标记 1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。 四、DNA自动化测序 荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。 1. 技术要点 （2）不同的标记对象 既可标记引物，也可标记ddNTP。 （4）分析自动化 （3）读片的自动化 激光探头直接读胶，实时阅读。 （2）反应的自动化 Sanger脱氧终止法。 电脑