基因工程-第五章重组基因导入受体细胞教程分析.pptVIP

SDS－PAGE电泳上样 浓缩胶（Stacking Gel）工作示意图 SDS－PAGE电泳结果示意图 标准分子量蛋白质（Protein Marker） 免疫显色及发光 SDS－PAGE电泳仪和电转槽 SDS－PAGE电泳仪和电转槽 SDS－PAGE制胶模具 1.2蛋白质双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis）： 1.2.1蛋白质分离技术包括：等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）和SDS－聚丙烯酰胺凝胶（SDS）两部分。 1.2.2原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的差异，利用电泳技术有效分离大量混合蛋白质组分的技术手段。 双向电泳原理 双向电泳凝胶结果图 双向电泳仪器 等电聚焦（IEF） 安放胶条 点样 SDS－PAGE 对凝胶进行染色，确定差异的蛋白点。 1.3蛋白质组学与蛋白质组学技术（Proteome and Proteome Technology）： 1）蛋白质组学（Proteome）： 蛋白质（Protein）与基因组（Genome）研究在形式和内容两方面的完美结合，致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 2）蛋白质组学技术（Proteome Technology）： 蛋白质双向电泳，色谱和质谱，生物信息学 对有差异的蛋白点进行质谱（Mass Spectrometry）分析 生物高分子质谱仪（Mass Spectrometry） 质谱仪（Mass Spectrometry）的工作原理 Chapter 5 Introductions of Recombinant Gene into Receptor Cells 第一节 受体细胞（Receptor Cells） 受体细胞，又称为宿主细胞（Host Cell）： 能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，具有一定的应用价值和研究价值的细胞。从原核生细胞到高等植物和动物细胞均可作为基因工程的受体细胞。 一、受体细胞应具备的条件和原则： 1.便于重组DNA分子的导入； 2.能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 3.便于重组体的筛选； 4.遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长； 5.安全性高，无致病性，无环境污染； 6.能使外源基因蛋白表达产物在细胞内积累或高效分泌表达； 7.在遗传密码的应用上无偏倚性； 8.有较好的翻译后加工机制。 二、原核受体细胞（Prokaryotic Receptor Cells）： 2.1大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）: 革兰氏阴性（Gram-negative）短杆菌，具鞭毛，能运动，无芽孢。研究最为详尽，应用最为广泛，基因工程研究与应用中最为完善和成熟的系统。 2.2大肠杆菌主要分两类： ①用于质粒DNA的复制扩增，如DH5α； ②用于外源基因的表达，如BL21（DE）； 三、真核受体细胞（Eukaryotic Receptor Cells）： 3.1酵母菌（Yeast）: 单细胞真核微生物，其优势： ①结构简单，基因表达调控机制了解得比较清楚，遗传操作简单； ②具有真核生物蛋白质翻译后修饰加工系统； ③安全性好；④培养简单；⑤能将外源基因分泌到培养基中，便于分离纯化。 3.2植物受体细胞（Plant）: 植物细胞由于具有坚硬的细胞壁，一般导入外源DNA比较困难，但可以用纤维素酶处理后获得的原生质同样可以摄取DNA。植物细胞最突出的优点是细胞具有全能性。 3.3动物受体细胞（Animal Receptor Cell）: ①昆虫（insect）受体细胞 ②哺乳类（Mammalian）受体细胞 ③人体胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC） 第二节 重组基因导入受体细胞（Introduction Recombinant Gene into Receptor Cells） 一、转化（Transformation）： 重组质粒DNA分子通过膜蛋白结合进入到受体细胞中，并在受体细胞内稳定维持与表达的过程。 Ca2+诱导大肠杆菌转化 二、转导（Transduction）： 通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞，将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。 具有感染能力的λ噬菌体颗粒必须将λDNA分子与λ头部蛋白和尾部蛋白进行体外包装形成具有侵染能力的病毒颗粒。 三、转染（Transfection）： 通过质粒DNA与转染试剂混合成宿主细胞能吞噬的颗粒而进入受体细胞，外源DNA分子在受体细胞内并稳定遗传的过程。 ①磷酸钙转