一种产异戊二烯基因工程菌及其应用.docVIP

本发明公开了一种异戊二烯属于技术领域。本发明通过将含有乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶本所提供的方法杆菌外源MVA的反应过程由乙酰辅酶A仅需避免了由于过多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响39.49μg/L。与已有文献的1091mg/L还有很大差距。本发明的创新之处在于提供了一种生物合成异戊二烯的新方法，大大缩短了工程大肠杆菌利用外源途径合成异戊二烯的反应过程。  一种产异戊二烯其特征在于，乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶根据权利要求乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因是乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因m末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT油酸水合酶基因是油酸水合酶基因Ohy一种权利要求生物合成异戊二烯的方法，其特征在于，通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶 根据权利要求乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶油酸水合酶将步骤 根据权利要求乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因根据权利要求3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因根据权利要求末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶根据权利要求油酸水合酶基因Ohyd为根据权利要求乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶油酸水合酶基因mvaSpACYDuet-1载体重组后获得重组质粒pACY-mvaE-mvaS；将步骤1）所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH载体与pCOLADuet-1载体重组后获得重组质粒pCOLA-OleT-OhydEM； 将步骤2）中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pCOLA-OleT-OhydEM转化入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中获得重组菌  一种异戊二烯 技术领域 本发明涉及一种异戊二烯属于技术领域。 技术背景 异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。 目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法( 包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、 丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。 生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。MVA 途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。 利用MVA途径和MEP途径生产异戊二烯的反应分别涉及8和9步反应，反应涉及过多的基因。随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50 微克/克干细胞/天的产率（Pia Lindberg等，2009），但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯（美国专利公开，2009/0203102）。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢。 发明内容 异戊二烯，乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因是乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因m末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT油酸水合酶基因是油酸水合酶基因Ohy一种生物合成异戊二烯的方法，通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因、末端烯烃形成脂肪酸脱羧