基本培养技术资料.ppt

（一）、茎尖脱毒 1、茎尖脱毒的原理 病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。 A、液体培养法液体培养液层0.5mm左右，可以加入一些Ficoll作为漂浮剂，使花药全部不下沉而漂浮在液面上，这样通气良好，提高了培养效果， 要注意及时转移沉于瓶底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养的效果 液体培养具有一定的优越性：在液体培养中不存在位置效应； 可以在培养过程中补加新鲜培养基和重新调整培养基的成分；液体培养有利于花粉粒的释放及分裂形成愈伤组织 但如何掌握转分化的时期等细微环节直接影响到花药培养的效果 液体培养 B、双层培养在35mm*10mm的小培养皿中铺加一层（1ml）琼脂培养基，固化后，在其表面再加入0.5ml的液体培养基。 优点：花药在培养的早期可以从活性高的液体培养基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没，可以在通气良好的条件下分化成植株。 C、条件培养基培养用预先培养过花药的液体培养基再次进行花药培养，可使花药培养效率大大提高。 条件培养基不存在种的特异性，例如培养过小麦花药的培养基对大麦同样有效。 4、花药培养中单倍体形成的途径 A、通过胚状体形成单倍体植株 ?低浓度激素B、通过愈伤组织形成植株 高浓度生长素 通过愈伤易产生混倍体 马铃薯花药培养中胚状体和愈伤组织的倍性 5、花药培养的意义 a、缩短育种年限 常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5—F6代能得到纯合后代。 用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）。这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可缩短育种年限3—4个世代。 b、提高选择效率F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因可以得到充分表达。 单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。  6、现阶段花药培养存在的问题①诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%，低的只有百分之几，千分之几②体细胞干扰问题（花丝、药壁、药隔）③倍性变异④药壁毡绒层细胞对花粉发育的作用，如何用合成培养基代替毡绒层的作用，还不十分清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性。⑤白化苗问题 二.花粉及小孢子培养 1、概念 花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程. 优点（与花药培养比）：a、分离的花粉培养不会出现不同倍性的个体，花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。 2．花粉培养的一般方法 ①预处理或预培养 要取得花粉培养的成功，必须在分离花粉前，先对花粉进行一定时间的预处理或预培养。 ②花粉粒的游离 分离花粉粒，应达到以下标准a：成活率较高，发育齐整 b：达到一定的数量 C：无菌，无杂质 常用的分离方法有： A自然散粉法 a固体培养 把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，使花粉继续培养生长。 b液体培养 这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉将其重新培养在新鲜培养基上。  B机械分离花粉粒  a：挤压法。 此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。 注意 （a）挤压时用力要适当而且均匀 （b）选用合适的筛网孔径 （c）分离液的渗透压要合适 b、搅拌器或超速旋切机法 将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中，在高速条件下搅拌一定时间，匀浆用筛网过滤，滤液在1000g离心，用培养液洗涤数次，用percoll（包