根霉固体发酵高产糖化酶发酵条件优化酶学性质的研究以及应用精要.docVIP

技术总结报告 根霉固体发酵高产糖化酶发酵条件优化、酶学性质的研究以及应用 经过一年多的时间，本项目从宜宾五粮液酒厂周边采集而来的土样中分离出六株产糖化酶且酶活较高的根霉菌株开始，首先选取酶活最高的一株K-1为出发菌，对其糖化酶的酶学性质、固体发酵产酶条件优化和对原料的分解力等方面进行了研究；此外对其产糖化酶根霉曲白酒酿造研究。 产糖化酶根霉的分离以及酶学性质的初步研究 摘要：从五粮液酒厂周边采集而来的土样中分离出六株产糖化酶且酶活较高的菌株，选取酶活最高的一株K-1 为出发菌，进行发酵实验，并测得糖化酶在50-55℃酶活较高，最适作用温度为55℃。且糖化酶在pH值5.5-6之间酶活力较高。酶对玉米粉、小麦粉、木薯粉、苦荞粉、黄豆粉有较强的液化能力，其中对玉米粉的糖化能力最强。在酶的动力学实验中测得Km=1.446mg/ml，Vm=0.269mg/ml.min 。 根霉细胞中不仅含有丰富的糖化酶，还含有一定的酒化酶系，可以边糖化边酒化同时含有能产生曲酒香味前体物质的酶系[1]。而且根霉比曲霉更具有糖化力高，适应性强、繁殖速度快等特点。生长速度快、对温度、湿度、营养的适应范围很广。 糖化酶是淀粉糖化酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3）的简称，又称为γ-淀粉酶（γ- amylase），糖化酶能从淀粉非还原性末端依次切下一个葡萄糖单位，将淀粉水解为葡萄糖。因此，它被广泛地应用于酒精、白酒酿造、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、纺织、日化等工生物业中[2]，是我国最大的工业酶制剂产品[3]，多年来对糖化酶的研究主要集中于提高菌株的产酶能力[3-5]改善发酵条件[6]。本实验的目的就是筛选复合酶系协同作用强的菌种，供葡萄糖生产或酿酒工业应用。有机酸、甘油、纺织、日化等工生物业中[2]，是我国最大的工业酶制剂产品[3]，多年来对糖化酶的研究主要集中于提高菌株的产酶能力[3-5]改善发酵条件[6]。本实验的目的就是筛选复合酶系协同作用强的菌种，供葡萄糖生产或酿酒工业应用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样来自：宜宾五粮液酒厂周边土壤 1.1.2 主要的药品与试剂：无菌水、3,5-二硝基水杨酸(DNS)[7]、2%可溶性淀粉溶液，pH=4.6乙酸-乙酸钠溶液[8]。生长因子： FeSO4(0.01％)、KCl(0.05％)、MgSO 4(0.05％)、(NH4)2SO4、NH4C1、KNO3、NaNO3、NH4NO3。 1.1.3 部分仪器及设备：高速冷冻离心机（飞鸽牌）， UV-2000紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），超净工作台等。 1.1.4 培养基：分离培养基：可溶性淀粉0.5g，蛋白胨 0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4?7H2O0.01g，CaCl2?2H2O0.05g，琼脂2.5g，pH为5.0 。0.1Mpa，121℃条件下灭菌30min，冷却至约50℃，倒5～6块平板/100mL，冷却备用。液体发酵培养基：可溶性淀粉2.0g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4?7H2O 0.01g，(NH4) 2SO4 0.1g，CaCl2?2H2O 0.05g，水100ml，pH为6.0。 1.2 方法 1.2.1 菌株分离及培养方法 称取5g土样，在研钵中研成粉末状，放入盛有45ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中。振摇10分钟，使样本与水充分混合。振荡混匀后静置，取上清液1ml与9ml无菌水试管中，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等各种稀释度的溶液，吸取各种稀释度溶0.1ml于分离培养基涂布均匀，置于30OC培养箱中培养48h。观察分离培养基平板长出的菌落周围有无透明水解圈，取水解圈较大者接种于筛选平板上划线分离离至纯种，斜面保存[9]。 1.2.2糖化酶活力的测定 葡萄糖标准曲线制作：分别在25ml的具塞试管中加入0ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml的1mg/ml的葡萄糖标准液, 加蒸馏水补至2ml,分别再加入3ml的DNS试剂，置沸水浴中煮沸5分钟，然后取出流水冷却，加蒸馏水10ml振荡摇匀，以无葡萄糖标准液管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线[10]。 糖化酶酶活力的定义： 1毫升酶液在55℃，pH6.0的条件下，每分钟水解可溶性淀粉产生1umol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U）（国标法糖化酶活力单位定义）。 酶活力单位（U/ml）= {[