第4章蛋白质的共价结构0解析：.pptVIP

1、N末端分析 （3）末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。 Edman法 此法是目前应用最广泛方法。 优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。 缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。 （4）N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。 N-末端分析 常见问题及处理方法： 经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂发生作用。 焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。 2、 C末端分析 （1）C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。 （2）多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 （3）羧肽酶法 将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。 3、二硫键的拆开和肽链的分离 肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。 如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。 最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。 二硫键拆开后形成的肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。 4、肽链的完全水解和氨基酸组成的测定 在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。 蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。 5、肽链的部分水解和肽段的分离 胰蛋白酶：专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨酸。 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。 以上方法中，酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键 肽段的分离：多肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。经常用双向层析或电泳分离，再用茚三酮显色，所得的图谱称为肽指纹谱。 酶法裂解总结 ①胰蛋白酶 Lys —X, Arg— X (X ≠Pro) ②胰凝乳蛋白酶 Tyr—X，Trp—X, Phe—X (X ≠Pro) 6、多肽链中氨基酸顺序的测定 从多肽链中部分水解得到的肽段可用Edman化学法、酶法、质谱法或气谱-质谱连用法测序，然后用小肽段重叠原理拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。 7、二硫键位置的确定 一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。 常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。 肽段的分离可用对角线电泳 pH6.5 过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。 四、蛋白质氨基酸序列与生物功能 1.同源蛋白质 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。 同源蛋白质一级结构（序列）的特点： （1）同源蛋白质氨基酸序列具有明显的相似性（同源性）。 （2）多肽链长度相同或相近有 （3）许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中个别氨基酸的变化 不影响蛋白质的功能。