第4章疏水层析解析：.pptVIP

内容提要 第一节 基本原理 疏水作用 吸附剂 第二节 操作与应用 层析柱的制备 加样和洗脱 应用实例 欲让亲水性强的蛋白质与疏水性固定相有效地结合在一起，一是靠蛋白质表面的一些疏水补丁；二是使蛋白质发生局部变性，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基；三是疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。 Type of base matrix Cross-linked agarose Synthetic copolymer materials 2．非亲水性吸附剂 在这类吸附剂中，所用的基质有硅胶、树脂（苯乙烯、二乙烯聚合物）等，配体为苯基、辛基、烷基（C4、C8、C18）等，二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。 第二节 操作与应用 一、层析柱的制备 二、加样与洗脱 三、应用实例 2．固定相 3．装柱 2．柱的再生 再生处理，即用8 M脲素溶液或含8 M脲素的缓冲溶液洗涤层析柱，接着用平衡缓冲液平衡。 Main stages in HIC Equilibrate the gel and the sample to binding conditions Apply the sample Wash out contaminants Elute Equilibration Sample application Washing out unbound material Elution Elution HIC 优缺点 三、应用实例 纯化鸡胗钙调蛋白 Purification of recombinant a-mannosidase from Pichia pastoris 思考题 疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有什么区别？请解释。 AIEX Technique Ultrafiltration UF Superdex 200 p.g. GF Purificationfactor Q Sepharose FF 10 times purification 82% yield Phenyl Sepharose HP HIC Y.-F. Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348 63 622 719 * 第四章 疏水层析Hydrophobic interaction chromatography，HIC 疏水层析和反相层析（reversed phase chromatography）分离生命物质的依据是一致的，即视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。 极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。 在反相层析中所用的基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力，欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相（降低极性）通过，方可见效。 疏水层析所用基质与反相层析不同，即疏水层析中的基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物容易被解析下来。因此，这类方法较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。 第一节 基本原理 一、疏水作用 二、吸附剂 一、疏水作用 二、吸附剂　 在疏水层析过程中，所使用的固定相一般是由基质和配体（疏水性基团）两部分构成，其配体对疏水性物质具有一定的吸附力，而基质则有亲水性和非亲水性之分。通常由亲水性或疏水性基质与吸附疏水性物质的配体构成的固定相又称亲水性或疏水性吸附剂。 固定相＝基质+配体 亲水性基质 疏水性基质 亲水性吸附剂 疏水性吸附剂 基质 目前这类吸附剂的基质主要是交联琼脂糖（Sepharose CL-4B），配体是苯基或辛基化合物，二者通过偶合方法构成稳定的苯基（或辛基）-Sepharose CL-4B吸附剂。 1．亲水性吸附剂 SOURCE 15 AGAROSE 一、层析柱的制备 1．层析柱规格 层析柱规格包括: 柱体积大小； 直径粗细； 柱高度（h）与其直径（d）的比值等。 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基（或辛基）-Sepharose CL-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose CL-4B吸附剂适合于分离纯化与芳香族化合物具有亲合力的物质。 辛基-Sepharose CL-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的物质。 将选定的亲水性吸附剂悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间后，采用离心（或过滤）方法，弃上清液，收集沉淀物，并以50％（m/v）浓度悬浮于样品缓冲液中，尔后按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。 加样